汪靈芝，黃煥森，廖敏，胡春旭

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州510260；

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東 廣州510120

細胞縫隙連接(gap junction，GJ)是廣泛存在于實質(zhì)性臟器(如心臟、肝臟、腎臟、中樞神經(jīng)、皮膚和肌肉等)組織細胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道。GJ由不同的連接蛋白(connexin，Cx)組成，6個Cx環(huán)繞在一起組成一個“半通道”(hemichannel)，又稱為連接子(connexon)。2個位于各自細胞胞膜上的“半通道”對接在一起形成一個GJ。有研究表明，GJ能增強化療藥物或者放射線對腫瘤細胞的細胞毒性作用［1-2］。本研究組其他成員的前期研究還發(fā)現(xiàn)，麻醉鎮(zhèn)靜藥丙泊酚能夠顯著減低Cx32組成的GJ功能，減弱X射線對宮頸癌細胞的殺傷作用［3］。與丙泊酚相似，依托咪酯也是非巴比妥類靜脈鎮(zhèn)靜藥。但由于依托咪酯對血流動力學(xué)的影響小，循環(huán)穩(wěn)定性優(yōu)于丙泊酚，被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉和ICU鎮(zhèn)靜［4］。但依托咪酯對GJ通訊的影響目前仍未見報道。鑒于鎮(zhèn)靜藥物主要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用，而Cx43是神經(jīng)系統(tǒng)表達最豐富的Cx，本研究將在天然表達Cx43 的人膠質(zhì)瘤細胞U87上觀察常用鎮(zhèn)靜藥依托咪酯對Cx43 組成的GJ 的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞和試劑

本研究所使用的U87細胞購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)；本研究中的主要試劑：胎牛血清，青-鏈霉素，胰酶和DMEM 干粉等細胞培養(yǎng)試劑購于美國Gibco公司；依托咪酯(2 mg/mL)為江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 人膠質(zhì)瘤細胞U87 的培養(yǎng)

將U87細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和青霉素、鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5 %、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞常規(guī)培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，并通過0.25%胰蛋白酶消化法進行傳代。實驗前將細胞培養(yǎng)24～48 h，使其表達形成有效的GJ。

1.2.2 SRB法測定依托咪酯的細胞毒性

磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)［5］是一種粉紅色的氨基甲氧雜蒽類化合物，該染料在酸性環(huán)境下，能與三氯醋酸(trichloroacetic acid，TCA)固定后的細胞內(nèi)大分子上的堿性氨基酸結(jié)合，結(jié)合染料的多少在一定范圍內(nèi)線性地反映了蛋白質(zhì)的量，而蛋白質(zhì)數(shù)量的多少與細胞的數(shù)目成正比。本實驗依據(jù)參考文獻［5］取不同濃度的依托咪酯作用U87細胞4 h，待藥物處理后，每孔加入50 μL冰冷的50% TCA(終濃度為10%)于4 ℃固定。倒掉固定液，用超純水沖洗、干燥后，每孔加入0.4% SRB，室溫染色30 min，用1% 醋酸洗去游離染料，空氣干燥后，每孔精確加入150 μL 10 mmol/L Tris溶解染料，用酶標(biāo)儀在564 nm波長處測定吸光度(D)值，以只加培養(yǎng)液的空白對照組調(diào)零。

1.2.3 細胞接種熒光示蹤法(parachute dye-coupling assay)［6］

檢測U87細胞的GJ熒光傳遞功能：取對數(shù)生長期細胞，以1.0×105個/mL接種于6孔板。隨機分為對照組、0.1 μmol/L依托咪酯組、0.5 μmol/L依托咪酯組和1 μmol/L依托咪酯組進行處理。將表達有Cx的細胞與熒光指示劑calcine-AM和DiI-CM共同溫育， 使calcine-AM和DiI-CM進入細胞。 該細胞稱為“供體細胞”(donor cell)。 將 “供體細胞”接種到接受過不同處理并已生長融合的U87細胞，即“接受細胞(receiver cells)”，培養(yǎng)4 h。待形成穩(wěn)定的GJ后，用顯微熒光系統(tǒng)觀察，記錄GJ功能。小分子的calcine(發(fā)綠色熒光)可以通過GJ進入相鄰的“接受細胞”； 但大分子的DiI 不能自由通過GJ而留在”供體細胞”內(nèi)， 使之易于識別。 計數(shù)一個“供體細胞”周圍含有calcine的“接受細胞”作為GJ功能指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩組之間計量資料比較進行t檢驗，多組之間計量資料比較進行ANOVA分析，組間比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計圖表采用Sigma Plot 10.0繪制。

2 結(jié) 果

2.1 依托咪酯對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的細胞毒性

為了排除依托咪酯本身的細胞毒性對GJ 數(shù)量的影響，我們首先用SRB法檢測不同濃度依托咪酯對U87細胞生長的影響，選擇對細胞生長無影響的依托咪酯濃度進行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，0.1、0.25、0.5、1和5 μmol/L 依托咪酯在4 h內(nèi)對U87細胞生長均無抑制作用(P＞0.05，表1)。

2.2 依托咪酯對Cx43組成的GJ功能的影響

細胞接種熒光實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，U87細胞經(jīng)0.1 μmol/L依托咪酯處理后，供體細胞周圍接受細胞數(shù)量無明顯變化，表明0.1 μmol/L依托咪酯對細胞間的GJ熒光傳遞功能無影響，而細胞經(jīng)0.5和1 μmol/L依托咪酯處理后，供體細胞周圍接受細胞數(shù)量明顯減少，GJ熒光傳遞功能分別降低了(27%±5%)和(43%±4%)%(P＜0.05)；1 μmol/L依托咪酯的抑制率與陽性對照組對U87細胞上GJ的抑制作用相比較弱［17］。實驗結(jié)果證明，依托咪酯可以顯著降低由Cx43所組成的GJ功能(圖1)。

表1 不同濃度依托咪酯對U87細胞生存率的影響Tab. 1 Effect of etomidate on viability of U87 cells

圖1 不同濃度依托咪酯對U87細胞熒光傳遞功能的影響Fig. 1 The effect of etomidate treatment at different concentrations on the dye spread of U87 cells through gap junctions assessed by parachute assay

3 討 論

在哺乳動物中，Cx蛋白幾乎在所有類型組織中都有不同程度的表達。細胞間通過Cx構(gòu)成的GJ進行信息和能量物質(zhì)交換，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細胞的增殖分化、機體的生長發(fā)育、傷口愈合等方面都發(fā)揮著重要的作用［6］。人體組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有21種Cx蛋白，Cx蛋白依據(jù)其相對分子質(zhì)量的大小命名，其中Cx43是分布最廣泛的一種縫隙連接蛋白。

研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中由不同Cx所組成的GJ，允許神經(jīng)元之間進行離子交換，是神經(jīng)元之間的電突觸結(jié)構(gòu)，參與介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞及神經(jīng)活動的同步化。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多的是星形膠質(zhì)細胞，細胞之間亦具有廣泛由Cx43組成的GJ。神經(jīng)膠質(zhì)細胞由Cx43組成的GJ在維持神經(jīng)系統(tǒng)的外環(huán)境穩(wěn)定及協(xié)調(diào)神經(jīng)元的某些功能方面起非常重要的作用［7-8］。以往研究表明部分吸入麻醉藥和靜脈麻醉藥能影響神經(jīng)組織中的GJ功能，研究者發(fā)現(xiàn)七氟醚、安氟醚、異氟醚、氟烷以及丙泊酚等麻醉藥可不同程度地阻斷GJ［9-10］，并推測這可能與這些藥物的麻醉作用機制有關(guān)。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，GJ抑制劑能夠增強全麻藥物七氟烷和丙泊酚的中樞抑制作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)依托咪酯能顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞Cx43組成的GJ，提示其對GJ功能的抑制可能參與其鎮(zhèn)靜催眠作用的產(chǎn)生。

近年大量研究顯示，Cx43所組成的GJ能夠增強化療藥物細胞毒性。GJ增強化療藥物細胞毒性的機制與“旁觀者效應(yīng)”(bystander effect，BE)有關(guān)。有學(xué)者認為，由化療藥物或者腫瘤自殺基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的死亡信號可能通過相鄰細胞間的GJ傳遞，導(dǎo)致單個細胞內(nèi)死亡信號的放大［12］。Jensen等［13］報道由Cx43所組成的GJ能夠顯著增強順鉑對小鼠永生型成纖維干細胞的毒性，而細胞轉(zhuǎn)染Cx43 RNAi后順鉑毒性明顯下降；我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)依托泊苷對睪丸癌細胞的毒性在有GJ存在的情況下顯著增強，而應(yīng)用GJ抑制劑能夠顯著減少由Cx43組成的GJ，從而降低依托泊苷的細胞毒性作用［14］。Cx43是神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞上的主要表達Cx。研究發(fā)現(xiàn)，針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的HSV-TK/GCV的治療在有GJ存在的情況下明顯增強，而抑制Cx43組成的GJ功能能明顯減弱HSV-TK/GCV對腫瘤細胞的作用［15-16］。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，由Cx43組成的GJ參與介導(dǎo)miR-124-3p對U87和C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的促凋亡作用［17］。由此我們推測，依托咪酯對GJ功能的抑制作用，可能會參與其調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的化療或者放療敏感性。另外，GJ通道的開啟及關(guān)閉受多種因素直接調(diào)控，如膜電位、pH 值、Ca2+、連接蛋白的磷酸化以及一些神經(jīng)體液因子、蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)因子以及外源性化學(xué)物質(zhì)等［18］。依托咪酯對GJ功能的影響是通過直接調(diào)控的方式或是間接通過影響Cx43的生存周期還有待我們下一步的深入研究。

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