楊珂，傅斌,2，王義兵，王共先,2，李軍華，劉仁升，齊雪亮，黃亮

1.南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西 南昌330006；

2.江西省泌尿外科研究所，江西 南昌 330006

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)學對膀胱腫瘤的認識已從整體水平發(fā)展到細胞、分子水平。其中有關信號通路與膀胱癌生物學行為的研究已經(jīng)成為熱點并取得了一定的成果。因此，研究與膀胱癌相關信號通路的關鍵基因的mRNA的表達對研究膀胱癌具有重要意義。

本研究應用德國Qiagen公司Human Cancer Pathway Finder PCR Array板，陣列配置84個基因代表參與影響腫瘤的9種不同的生物信號通路表達，包括：細胞凋亡、細胞周期、DNA損傷修復、細胞衰老、端粒維持、新陳代謝、血管生成、細胞缺氧及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)，并通過qRT-PCR驗證，探究其通過對信號通路的影響與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本收集

在符合臨床研究倫理道德標準的情況下，收集2014年3月—5月南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科經(jīng)病理診斷為膀胱癌組織標本及其周圍正常組織各27例，納入本實驗膀胱癌標準為：分期T2～4a，N0-X，M0，手術(shù)方式為膀胱根治性切除的患者，通過前期實驗發(fā)現(xiàn)根治性手術(shù)對標本影響較小，可以更為完整地提取總RNA。收取膀胱癌組織和癌旁5 cm以上的正常組織， 在保障病理學檢測所需標本的前提下，盡量提供足量的腫瘤和癌旁正常組織，一般不少于200 mg或107個細胞［1］。液氮速凍保存。

1.1.2 實驗儀器

液氮罐(上海金鳳五金塑膠有限公司)，-80 ℃冰箱(德國Siemens公司)，-20 ℃冰箱(中國青島海爾股份有限公司)，電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，分光光度計(美國Thermo公司)，熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，高速離心機(德國Eppendorf公司)，移液器(德國Eppendorf公司)。

1.1.3 實驗試劑

QIAzol(德國Qiagen公司)，RNeasy Mini Kit試劑盒(德國Qiagen公司)，Rt2 First Strand試劑盒(德國Qiagen公司)，PrimeScript RT reagent Kit(寶生物工程(大連)有限公司)，SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit (寶生物工程(大連)有限公司)，SNAI3、GSC、KRT14、DSP、SNAI2和β-actin引物(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，其他試劑：氯仿、異丙醇、溴化乙錠、TBE電泳緩沖液(50×)、瓊脂糖等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

在實驗前應準備好DEPC水處理好的研缽及槍頭，并戴好口罩、帽子，避免RNA酶污染。采用冰凍切片，用HE染色的方法來定性膀胱癌組織及正常膀胱組織，取兩組不多于100 mg組織(盡量保持組織處于冷凍狀態(tài))，用研缽磨碎至粉末狀，加入QIAzol Lysis Reagent 1 mL混勻。采用RNeasy Mini Kit試劑盒提取總RNA。

1.2.2 RNA濃度和質(zhì)量檢測

用分光光度儀分析RNA濃度和純度，將溶解于無核酶水中的RNA置于冰盒中，并用2 μL無核酶水作對照基線，取2 μL RNA溶解液，測濃度。合格的RNA樣本應該滿足D260∶D230比值大于1.7，D260∶D280比值在1.8和2.0之間，D260測出的濃度必須>40 μg/mL。RNA瓊脂糖凝膠電泳測RNA的完整性，制作1%瓊脂糖凝膠，將RNA進行電泳。

1.2.3 cDNA合成

使用RT First Strand Kit合成cDNA，解凍RT First Strand Kit的試劑。用簡短離心15 s，使管中的試劑沉至管底。保持在42 ℃ 15 min，然后放入95 ℃保持5 min。將反應物中加入91 μL無RNA酶水，用加樣槍混勻。

1.2.4 熒光定量PCR反應

簡短離心10～15 s把RT SYBR Green Mastermix試管中試劑沉至管底?？稍谑覝叵逻M行。在96孔板中加入PCR反應混合物，每孔25 μL。每一步驟使用新的加樣槍頭，避免孔間污染。透光黏性密封膜密封96孔板。在室溫下離心去除氣泡。設定Applied Biosystems，把Cancer Pathway Finder PCR Array板放在實時PCR儀中。開始PCR實驗。

1.2.5 標本驗證

按表1設計合成引物，實時熒光定量PCR驗證，將所收集的膀胱癌患者組織及正常組織，以及膀胱癌細胞株5637、J83和T24，使用上文所述方法提取RNA，并使用PrimeScript RT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit進行實時熒光定量PCR。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析， 計量數(shù)據(jù)以±s 表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 冰凍切片

對膀胱癌組織和正常膀胱組織做冰凍切片，HE染色結(jié)果見圖1。

2.2 RNA質(zhì)量檢測

所有樣品用紫外分光光度計法測定D260和D280，D260∶D230>1.9，D260∶ D280值均在1.8～2.0之間。并取5 μL總RNA溶液經(jīng)甲酵變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性，在紫外線下可見18 s及28 s兩條明亮清晰的條帶(圖2)。

圖1 膀胱癌組織和正常膀胱組織冰凍切片F(xiàn)ig. 1 Bladder cancer tissues and normal bladder tissue

表1 qRT-PCR引物序列及反應條件Tab. 1 The primer sequence and reaction condition of qRT-PCR

圖2 膀胱癌組織和正常組織總RNA電泳圖Fig. 2 Total RNA agarose gel electrophoresis of bladder cancer tissues and normal bladder tissue

2.3 RT-PCR Array數(shù)據(jù)分析結(jié)果

所提取總RNA使用Rt2 First Strand試劑盒逆轉(zhuǎn)成cDNA，并行qRT-PCR反應，獲得了所有通路84個關鍵基因及內(nèi)參基因的Ct值，并對其作lg2-ΔCt，同時對數(shù)據(jù)應用GraphPad Prism 6進行統(tǒng)計學分析(圖3)。當膀胱癌和正常組織表達差異越小時數(shù)據(jù)越靠近一、三象限等分線，因此越偏離等分線則表達差異越大。據(jù)此，得到顯著上調(diào)基因8個，顯著下調(diào)基因19個。本研究選擇影響EMT的信號通路作為研究方向，可見GSC、KRT14和DSP基因上調(diào)，SNAI2、SNAI3基因下調(diào)(圖4)。

2.4 qRT-PCR驗證結(jié)果

對篩選出的興趣基因：GSC、KRT14、DSP、SNAI2、SNAI3基因，進行多病例驗證，以及在3種膀胱癌細胞株5637、J83及T24上進行驗證，驗證RT-PCR Array中得出的結(jié)果是否可靠。對上述多次qRT-PCR所得數(shù)據(jù)進行分析(圖5)。上調(diào)基因中，GSC在驗證的癌組織與腫瘤細胞株中表達均低于正常組織，但差異無統(tǒng)計學意義，該結(jié)果與H u m a n Cancer Pathway Finder PCR Array實驗結(jié)果不一致；而K R T 1 4、D S P 基因在膀胱癌中表達顯著高于正常組織(P ＜0.0 5)，下調(diào)基因SNAI2、SNAI3在膀胱癌中表達顯著低于正常組織(P＜0.05)，且以SNAI3表達差異最顯著。

圖3 膀胱癌組織與正常膀胱組織行Human Cancer Pathway Finder PCR Array所得ΔCt值的分布Fig. 3 Distribution of ΔCt values of bladder cancer tissues and normal bladder tissues resulted from Human Cancer Pathway Finder PCR Array

圖4 根據(jù)RT-PCR Array檢測篩選基因的mRNA表達水平Fig. 4 mRNA relative expression of genes that was screened in bladder cancer by RT-PCR Array

圖5 對所選基因在多樣本和膀胱細胞株中進行qRT-PCR驗證所得的mRNA表達水平分布情況 Fig. 5 The distribution of 2-ΔΔCt of the screened genes by repeating qRT-PCR

3 討 論

膀胱腫瘤是嚴重威脅人類健康的重要疾病之一［2］，也是泌尿外科最常見腫瘤［3-4］，因此，在基因水平上研究膀胱癌發(fā)病具有重要意義。本研究從影響腫瘤的9個方面信號通路中篩選出可能與膀胱癌相關的關鍵基因作為興趣基因，來探究膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機制，并希望通過本研究為膀胱癌的預防及治療提供新思路。通過RT-PCR Array技術(shù)篩選出具有表達差異的影響EMT信號通路的基因作為興趣基因：GSC、KRT14、DSP、SNAI2、SNAI3基因，經(jīng)多樣本qRT-PCR驗證：KRT14、DSP基因在膀胱癌中表達顯著高于正常組織(P＜0.05)，SNAI2、SNAI3基因在膀胱癌中表達顯著低于正常組織(P＜0.05)，其中以SNAI3基因膀胱癌 組織和正常膀胱組織表達差異最大。

KRT14屬于角蛋白編碼家族，其對上皮組織早期發(fā)育有重要影響［5］，此外KRT14還可能參與維持細胞增殖潛力，并可以調(diào)節(jié)Notch-1依賴性細胞分化［6］，Notch信號通路通過對EMT的誘導而影響腫瘤已經(jīng)得到廣泛證實［7-8］。本研究中KRT14在膀胱癌組織中表達高于正常組織，KRT14在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中可能通過上述通路發(fā)揮作用。DSP可以抑制Wnt/β-catenin信號通路［9］，而Wnt/β-c atenin信號通路在人類眾多腫瘤中起到重要作用已經(jīng)得到廣泛證實［10］，與此同時Wnt/β-catenin信號通路還能通過影響EMT進程來影響腫瘤發(fā)生［11］，其在膀胱癌中表達高于正常組織，因此，其可能通過上述作用影響膀胱癌發(fā)生進程。SNAI3作為轉(zhuǎn)錄因子參與E-cadherin的轉(zhuǎn)錄［12］，而E-cadherin的缺失是發(fā)生EMT的主要標志［13-14］，SNAI3表達的抑制而促使正常膀胱黏膜上皮E-cadherin 的缺失而發(fā)生EMT，因此，SNAI3可能通過影響EMT來影響膀胱組織癌變進程。本研究qRTPCR驗證顯示(圖4)，在膀胱癌組織中SNAI3的表達受到抑制而明顯低于正常組織，可以推斷SNAI3的表達對維持正常膀胱組織對抗EMT有重要意義，SNAI3表達的缺失可能誘導EMT的發(fā)生。

本研究通過對大量基因進行篩選及驗證，推測KRT14、DSP和SNAI3基因可能與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關系，并值得采用進一步的體內(nèi)或體外實驗方法對其作用機制深入研究，可能為基因治療膀胱癌提供重要靶點。

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