葛振萍

(沈陽職業(yè)技術(shù)學院 遼寧沈陽 110045)

序列是生物信息學中的數(shù)學模型的一種,占有基礎(chǔ)性的地位,用于組織存儲核酸分子和蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)。在生物研究領(lǐng)域,序列分析是重要的研究內(nèi)容,通過對生物序列的分析,可以對生物研究對象的功能與結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)的有效信息進行研究。在昆蟲系統(tǒng)學中,一直一類一直采用傳統(tǒng)分類學對昆蟲的形態(tài)進行具體的分類,但是傳統(tǒng)分類學在屬和種,特別是近緣種的分類中具有一定的局限性。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和進步,分子生物學技術(shù)在昆蟲系統(tǒng)學中逐漸加以應用,其中以核酸序列分析中的核糖體DNA應用最為廣泛,有效的彌補了傳統(tǒng)分類學的缺陷。核糖體DNA序列分析與傳統(tǒng)分類學相結(jié)合,在昆蟲系統(tǒng)學研究中發(fā)揮了重要的作用。

1 核糖體DNA結(jié)構(gòu)

生物分類中應用DNA序列分析的方法是建立在生物進化理論和遺傳理論的基礎(chǔ)之上的。自然界中的生物在不斷地進化后,種類十分豐富而且具有一定的秩序性。祖種經(jīng)歷了漫長的升級和進化在不同的地域,不同的環(huán)境條件下進行分化,形成了現(xiàn)今復雜的自然生物系統(tǒng)。核酸是生物之間的遺傳物質(zhì),帶有遺傳基因,雖然經(jīng)歷了漫長的進化和變異的過程后,但是仍然帶有物種進化歷史的信息和痕跡,因此通過對核酸序列的分析必然會探知不同生物物種之間的血緣關(guān)系,為昆蟲系統(tǒng)的分類提供可靠的依據(jù)。

核糖體DNA,簡稱rDNA,是編碼核糖體RNA的基因,在專司蛋白質(zhì)合成的細胞器中廣泛的分布,包括RNA和大亞基、小亞基組成,其中RNA占60%的比重,而大小亞基又是由蛋白質(zhì)組成的。細胞質(zhì)rDNA又可分為四種,前三種為28S rRNA(4 718 bp)、5.8S rRNA(160 bp)、5S rRNA(120 bp),在大亞基中存在,另外一種為18S rRNA(1 874 bp),在小亞基中存在。細胞質(zhì)核糖體18S、5.8S、28S、rDNA重復單位如下圖1所示。

圖1 細胞質(zhì)核糖體18S、5.8S、28S、rDNA重復單位

細胞質(zhì)核糖體rDNA具有總體進化速度不高、保守性的特點,在昆蟲系統(tǒng)學中適合在較高級階元的分類中應用較為適合。18S、5.8S、28S rDNA三者間具有不同的保守性,因此在系統(tǒng)發(fā)育研究方面也分別適用于不同的階元。在間隔區(qū)也有不同程度的多變區(qū)存在,通過對多變區(qū)的合理利用,能夠?qū)Σ扇⌒螒B(tài)學方法區(qū)分困難的屬和種進行區(qū)別。5S、5.8S rDNA因為序列較短,能夠提供的系統(tǒng)發(fā)育信息量很有限,很少在昆蟲系統(tǒng)學的研究中加以應用。

2 rDNA序列在昆蟲系統(tǒng)學研究中的應用

2.1 rRNA基因編碼區(qū)

在昆蟲系統(tǒng)學中,因為分類學意義的不同序列應用的范圍也有所差異。5S、5.8S rDNA在不同的染色體轉(zhuǎn)錄單元中存在,但是它們的堿基對都僅有100多個,序列都很短,因此進化呈緩慢狀態(tài),在昆蟲中僅能夠提供少量的系統(tǒng)發(fā)育信息,在昆成系統(tǒng)發(fā)育研究應用很少。18 rDNA存在于編碼細胞質(zhì)核糖體小亞基中,對于蛋白質(zhì)的合成發(fā)揮著非常重要的作用,與5S、5.8SrDNA相比較,18rDNA高度保守,在科級以上階元之間存在一定的差異。而且該序列長度適中,不僅為昆成系統(tǒng)學研究提供有效的系統(tǒng)發(fā)育信息,而且在實驗室操作方面也比較容易。同時在該序列兩段還有高度保守區(qū),還便于設計通用引物進行序列擴增,因此應用廣泛。28S rDNA存在于編碼細胞質(zhì)核糖體大亞基中,相對應其他序列而言,該基因的序列長度是最長的,在進化過程中該序列具有重要的生物學功能因此也比較保守,但是其具有較大變異性,在序列中包括12個高變區(qū),在解決從種到科級水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中發(fā)揮重要的作用。在昆成系統(tǒng)學中,該序列在蜚蠊目、膜翅目、雙翅目等類群中應用最為廣泛。16S、12SrDNA存在于線粒體DNA環(huán)狀分子中,主要應用在屬和種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中,二者相較而言16SrDNA應用范圍更廣泛一些類群既涉及到全變態(tài)的膜翅目、鱗翅目等,同時也涉及到不全變態(tài)的同翅目及、半翅目等。

2.2 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū),以下簡稱ITS,被5.8 S rDNA分成ITSI、ITS2兩段,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對核糖體的形成不發(fā)揮作用,這樣選擇壓力不大,自然進化速度快,多應用于屬間、種間的系統(tǒng)發(fā)育及種群分化方面的研究。其中的ITS2序列因為保守性高,兩段序列非常保守,便于設計引物進行PCR擴增,在從形態(tài)上極其相似但生理生化方面有差異的復合體的研究方面尤其適宜。從目前應用情況來看,ITS1和ITS2在研究近緣種的鑒定方面應用比較廣泛,二者之間以ITS2應用更多。

2.3 基因間隔區(qū)

基因間隔區(qū),以下簡稱IGS,在昆蟲系統(tǒng)學研究中所應用的主要是與18S、28S rDNA在染色體上處于同一轉(zhuǎn)錄單元的IGS,它由NTS、ETS2、ETS1組成,含有rRNA的轉(zhuǎn)錄啟動子和促進轉(zhuǎn)錄的增強子,屬于高度變化區(qū)。從應用中來看,IGS在研究種及以下水平相互關(guān)系中較為適用。對于IGS的NTS區(qū),其變化度最高,對其多態(tài)性的分析多采用間接地方法,用以對近緣種進行鑒別和研究。IGS序列相較于其它序列要長得多,對其全程測序是很困難的,這也在一定程度上阻礙了該序列在研究中的應用。

3 rDNA序列分析方法

3.1 標本處理

在昆蟲系統(tǒng)學中,昆蟲核酸的提取質(zhì)量非常重要,直接影響核糖體DNA的序列的獲得荷分析,進而影響研究結(jié)果的準確性,而昆蟲的標本處理是提取昆蟲核酸最基本的步驟。實驗室常用的昆蟲標本處理標本主要有乙醇固定、烘干、陰干、冷凍等方法。其中乙醇固定要求采用比例為70%、95%或者無水乙醇進行固定;烘干法要求烘箱溫度為50～60℃,烘干時間為24小時;陰干法是在自然條件狀態(tài)下陰干;冷凍法要求在冰箱溫度在零下80℃的條件下。通過研究對比發(fā)現(xiàn),采用無水乙醇固定以及冷凍方法處理的標本提取DNA的質(zhì)量為最優(yōu)。而陰干處理方法對環(huán)境濕度要求較高,如果濕度不當回導致標本霉變,DNA降解直接影響分析結(jié)果。

3.2 總DNA的提取

生物技術(shù)的不斷發(fā)展進步,新方法的不斷研發(fā),昆蟲總DNA的提取操作越發(fā)簡單化、多樣化發(fā)展。即使采用的是同樣的DNA提取方法,不同的操作者在試劑的濃度、試劑的種類方面也會有所差別。研究人員可以根據(jù)實際的需要選擇適合的提取方法,配置適宜ide試劑濃度來提取昆蟲總DNA。

3.3 rDNA目的片段PCR擴增及測序

rDNA不僅具有多變區(qū),同時還具有保守區(qū),這是rDNA能夠用于對不同親緣關(guān)系的物種進行分類和鑒別的主要依據(jù)。通常在rDNA中變壞最為突出的部分為NTS,而ITS由ITS1和ITS2組成,也存在較大的變異,因此NTS和ITS均不適宜進行引物設計。rDNA中的5.8S、18S、和28S具有高度的保守型,有利于通用引物的設計,可在PCR擴增中加以利用。

3.4 rDNA序列分析方法

對提取的rDNA序列進行分析可以得到DNA堿基組成、密碼子的偏向、內(nèi)部重復序列等多方面與系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的信息。通常參照國際公認的核苷酸數(shù)據(jù)庫對DNA序列信息進行相似性的比較,并通過軟件如Clustal W 1.8、DNAStar7.1等軟件進行DNA序列分析。在rDNA系統(tǒng)的基礎(chǔ)上建立系統(tǒng)發(fā)生樹,用以將物種的進化關(guān)系采用樹的形式來加以描述,這也使分析研究的結(jié)果更加準確、直觀的展現(xiàn)出來。系統(tǒng)發(fā)生樹目前常采用鄰接法、最大簡約法、最小進化法等方法來進行構(gòu)建。

4 結(jié)語

隨著生物學技術(shù)的發(fā)展,在核糖體DNA序列的分析方面,無論從DNA的提取技術(shù)、測序以及分析的技術(shù)方法上都有了長足的進步,已經(jīng)逐步發(fā)展成熟,不僅可以應用到昆蟲中甘、科等高級階元的分類,而且可以應用到屬、種,甚至種下水平相互關(guān)系的研究。同時根據(jù)序列的保守性和變化性來建立不同階元的分子鑒定標準,對疑難綜合那個的分類和地位的確定具有重要的作用。

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