尹文龍　郝英魁　全紅娜　潘雁濤　蔣慶峰

[摘 要] 目的：建立YNC 3個(gè)異構(gòu)體的HPLC拆分法。方法：采用CHIRALPAK AD-H柱（4.6×250 mm，5 μm），以正己烷-異丙醇（82：18）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm。結(jié)果與結(jié)論：在選定色譜條件下YNC與其3個(gè)異構(gòu)體完全分離，可用于本品的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] YNC；異構(gòu)體；高效液相色譜；手性固定相

中圖分類號(hào)：R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）02-061-03

YNC是一種新型選擇性膽固醇吸收抑制劑，有調(diào)節(jié)血脂功效，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)廠家生產(chǎn)。YNC結(jié)構(gòu)中有3個(gè)手性中心，理論存在多個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，然而臨床以單一構(gòu)型給藥。為了確保用藥安全，控制YNC異構(gòu)體雜質(zhì)限度具有重要意義。

本文建立了對(duì)YNC其中3個(gè)異構(gòu)體HPLC拆分法，此方法靈敏度高，重復(fù)性好，為YNC進(jìn)一步質(zhì)量研究提供可靠分析方法及理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters E2695高效液相色譜儀（2489型檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；Empower3色譜軟件（美國(guó)Waters公司）。

1.2 試劑

正己烷、異丙醇、乙醇（色譜級(jí)，F(xiàn)isher Scientific）；Milli-Q超純水；YNC供試品（天津藥物研究院，批號(hào)：1401，1402，1403）；YNC1、YNC2、YNC3異構(gòu)體對(duì)照品（天津藥物研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：CHIRALPAK AD-H （4.6×250 mm，

5 μm）；流動(dòng)相：正己烷-異丙醇（80：20）；檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm；流速：1 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量

20 μL。

2.2 溶液配制

精密稱取YNC 20 mg于10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，各取1 mL至100 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）稀釋至刻度，濃度為 20.00μg/mL，作為YNC儲(chǔ)備液，同法分別配置YNC1、YNC2、YNC3異構(gòu)體儲(chǔ)備液，各異構(gòu)體儲(chǔ)備液最終濃度依次為YNC1 20.3 μg/mL、YNC2為21.0 μg/mL、YNC3為 22.0 μg/mL。

2.3 專屬性

2.3.1 精密稱YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。同法進(jìn)樣YNC1、YNC2、YNC3異構(gòu)體儲(chǔ)備液，各樣品保留時(shí)間為YNC：20.001min；YNC1：14.332min；YNC2：21.830min；YNC3：25.695min。

2.3.2 加熱破壞 精密稱取YNC供試品100 mg至50 mL燒瓶中，加10 mL異丙醇溶解，正己烷-異丙醇（80：20）定容至刻度，于80 ℃水浴回流加熱0.5 h，放至室溫。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，同法以異丙醇作為加熱試驗(yàn)空白對(duì)照。

2.3.3 光照破壞 精密稱取YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，于光照室（光照強(qiáng)度4500xl）放置一天，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，同法以正己烷-異丙醇（80：20）作為光照試驗(yàn)空白對(duì)照。

結(jié)果表明，在上述條件下均有不同程度降解，并且各破壞條件下降解產(chǎn)物均與主峰達(dá)到良好分離，說(shuō)明本法專屬性較強(qiáng)。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

分別稱取YNC、YNC1、YNC2、YNC3適量，用正己烷-異丙醇（80：20）溶解并稀釋制成每mL約含YNC為2μg，YNC1、YNC2、YNC3約為0.5μg溶液，即為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5針系統(tǒng)適應(yīng)性溶液，記錄色譜圖，見圖1。

1.YNC1；2.YNC；3.YNC2；4.YNC3

上述色譜條件下分析，理論板數(shù)以YNC和其異構(gòu)體計(jì)均大于3000，YNC峰及其異構(gòu)體與相鄰色譜峰間分離度大于1.5，拖尾因子符合要求，如表1所示。

2.5 檢測(cè)限與定量限

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別將YNC、YNC1、YNC2、YNC3儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋至信噪比（S/N）10倍作為定量限，測(cè)得YNC定量限濃度為0.320 μg/mL、YNC1為0.324 μg/mL、YNC2為0.210 μg/mL、YNC3為0.308 μg/mL；稀釋至信噪比（S/N）3倍作為檢測(cè)限，測(cè)得YNC為0.0960μg/mL檢測(cè)限濃度為YNC1為 0.0972μg/mL、YNC2為0.0630 μg/mL、YNC3為0.0924 μg/mL。

2.6 線性

精密量取YNC儲(chǔ)備液各0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、2.0 mL至10 mL容量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，并取其定量限溶液，即為各濃度線性溶液。同法配置YNC1、YNC2、YNC3各線性溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，每濃度進(jìn)樣3針，記錄色譜圖。

以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以3針?lè)迕娣e平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明YNC1、YNC2、YNC3對(duì)照品在各自測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 重復(fù)性

精密稱6份YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。按“2.1.”項(xiàng)下：總雜質(zhì)峰面積和YNC主峰面積計(jì)算得主峰峰面積RSD為1.49% 總雜質(zhì)RSD為1.44%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性

精密稱取YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，室溫放置，在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。按總雜質(zhì)峰面積和YNC主峰面積計(jì)算得主峰峰面積RSD為1.20% 總雜質(zhì)RSD為3.25%，表明本品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 回收率

精密稱9份批YNC 20 mg至10 mL容量瓶中，每份加2 mL異丙醇溶解，然后每3份為1組，依次加入YNC1、YNC2、YNC3儲(chǔ)備液各0.8 mL、1.0 mL、1. 2 mL至3組容量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，即得9份回收液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

上述色譜條件下分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示YNC1、YNC2、YNC3回收率均在90%～110%之間，符合要求。

2.10 耐用性實(shí)驗(yàn)

分別考察了流速變化±0.1 mL/min、柱溫變化±3 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)變化±3 nm、流動(dòng)相比例變化±3%條件下系統(tǒng)適用性和有關(guān)物質(zhì)含量變化，表明系統(tǒng)適用性均符合要求，異構(gòu)體含量無(wú)明顯變化，表明方法耐用性良好。

2.11 校正因子測(cè)定

按線性測(cè)定方法計(jì)算得YNC對(duì)照品線性方程為Y=53515X-4851.9 R=0.9994。則YNC1、YNC2、YNC3校正因子分別為0.93、0.97、1.07。各異構(gòu)體校正因子均在0.9～1.1之間，可按不加校正因子主成分自身對(duì)照法測(cè)定各異構(gòu)體含量。

2.12 樣品異構(gòu)體檢查

精密稱取YNC原料藥20 mg于10 mL容量瓶中，加2 mL異丙醇溶解，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，配置成2 mg/mL YNC供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用正己烷-異丙醇（80：20）定容，作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰峰高為滿量程10%～20%。再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果只檢出YNC2異構(gòu)體，按不加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算，YNC1401、1402、1403批原料藥中異構(gòu)體YNC2含量分別為0.07%、0.06%、0.07%；各批結(jié)果均小于0.1%，即小于對(duì)照溶液峰面積1/10，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 色譜柱選擇

我們初步嘗試CHIRALPAK IA、AS-3、AD-H柱（規(guī)格均為4.6×250 mm，5 μm）對(duì)樣品進(jìn)行分離考察，結(jié)果顯示，各異構(gòu)體在IA柱下保留時(shí)間接近，分離度差；在AS-3柱中各異構(gòu)體峰理論塔板數(shù)較低；AD-H柱能對(duì)其3個(gè)異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)分離，且分離效果良好，因此選擇AD-H。

3.2 流動(dòng)相優(yōu)化

考察了正己烷-乙醇、正己烷-異丙醇2個(gè)流動(dòng)相體系，異構(gòu)體定位試驗(yàn)顯示，2個(gè)體系中各異構(gòu)體出峰時(shí)間和出峰次序區(qū)別很大，由于正己烷-異丙醇體系中各峰理論塔板數(shù)明顯高于正己烷-乙醇體系，見表5。因此選用正己烷-異丙醇作為本試驗(yàn)流動(dòng)相體系。

4 結(jié)論

用HPLC法對(duì)手性藥物拆分主要有手性衍生化法，手性流動(dòng)相添加劑法，手性固定相法，其中手性固定相法應(yīng)用最為普遍。CHIRALPAK AD-H柱固定相為表面涂敷了手性多聚物[直鏈淀粉-三（3，5-二甲基苯氨基甲酸酯）]球形硅膠，對(duì)大多數(shù)異構(gòu)體有極高手性能力。

本文采用CHIRALPAK AD-H柱成功拆分了YNC3個(gè)光學(xué)異構(gòu)體，分離度良好。所建立靈敏度高，分析方法快速，適用于YNC原料藥中異構(gòu)體雜質(zhì)檢查。

參 考 文 獻(xiàn)

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