宋要強，屠蔭華，惠 偉

(1.陜西師范大學生命科學學院，陜西西安 710062;2.陜西化龍山國家級自然保護區(qū)管理局，陜西鎮(zhèn)坪 725600;3.岐山縣食品藥品監(jiān)督管理局，陜西岐山 722400)

杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge)是薔薇科棠梨屬落葉喬木，是梨、蘋果等嫁接繁殖的優(yōu)良砧木;而且杜梨根系發(fā)達適應性強是荒山造林的先鋒樹種。但是杜梨種子成熟后有較長的休眠，采收后必須經過長時間的低溫層積處理才能萌發(fā)，費時費力，損失嚴重。因此研究杜梨休眠有很高的理論價值和實用價值。關于打破杜梨種子休眠的研究比較少，只有幾篇GA、ABA、6-BA參與杜梨休眠的報道，但是NO在杜梨種子休眠中的作用至今還未見報道。NO是植物體內存在的信號分子，調節(jié)著NO參與植物生長發(fā)育、種子萌發(fā)、氣孔運動、細胞凋亡以及植物抗逆反應等生理過程［1～3］。最近研究發(fā)現(xiàn)NO在擬南芥［4］、溫季牧草［5］、蘋果［6］等植物種子的休眠解除中也起著非常重要的作用。

經過多年的研究，大家公認的植物體內NO合成途徑有3條:(1)一氧化氮合成酶(NOS)的合成途徑［7～9］，(2)硝酸還原酶(NR)的生成途徑［10，11］，(3)非酶促反應生成途徑［12］。

本研究以杜梨為實驗材料，研究了NO在打破杜梨種子休眠中的作用，及杜梨種子萌發(fā)時內源一氧化氮的合成途徑，為種子休眠的理論研究提供試驗依據(jù)，同時為生產上打破休眠提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

購買2013年當年的杜梨(Pyrus betulifolia Bunge)種子，購入后于玻璃瓶內密閉，4℃低溫保存。實驗用硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)、2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧-3-氧化物(PTIO)、NG-氮-L-精氨酸-甲酯(L-NAME)為美國sigma公司生產。氯化汞(HgCl2)和鎢酸鈉(Na2WO4)來自國內。

光照培養(yǎng)箱是上海悅豐儀器儀表有限公司生產的GC-250型微機光照培養(yǎng)箱。

1.2 種子處理

種子經過0.1%的HgCL2溶液消毒3 min、沖洗后，在20℃下蒸餾水中浸泡24 h，讓實驗種子吸水膨脹。浸泡后用濃度為1 mM，5 mM，10 mM，20 mM的外源NO供體SNP處理，以蒸餾水處理為對照，處理時間為24 h，溫度20℃。為了檢驗NO的作用和NO的合成途徑，進行了NO清除劑PTIO、NO合酶抑制劑L-NAME和硝酸還原酶抑制劑Na2WO4的處理，PTIO處理濃度為200μg·L-1，Na2WO4處理濃度為10 mM，L-NAME處理濃度為200 μM;處理時間24 h，處理在20℃的培養(yǎng)箱內進行。

1.3 種子培養(yǎng)

用培養(yǎng)皿濾紙法培養(yǎng):培養(yǎng)皿直徑90 mm。處理后倒出處理液，蒸餾水沖洗4次～5次，后均勻平鋪在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿中鋪一層濾紙，加5mL蒸餾水。每個培養(yǎng)皿30粒種子，每個處理3個重復。培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱內進行，溫度20℃，光照周期為12 h光照和12 h黑暗。

1.4 發(fā)芽率的測定

開始發(fā)芽后每天固定時間對發(fā)芽率進行統(tǒng)計，胚根突破種皮為發(fā)芽。發(fā)芽率(%)=發(fā)芽個數(shù)÷30×100%。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的SNP對杜梨種子休眠的影響

經24 h浸泡杜梨種子充分吸水膨脹后，用不同濃度的SNP處理種子的萌發(fā)情況見圖1，從中可以看出SNP處理從1到20 mM都能提高杜梨種子萌發(fā)率，隨著SNP濃度的增加，杜梨種子萌發(fā)率也隨之增加，SNP濃度越高，萌發(fā)率越高。10 mM和20 mM SNP處理的種子14 d時萌發(fā)率分別達到56.7%和58.9%，是對照(20.0%)的2.8倍和2.9倍，差異極顯著(P＜0.01)。20 mM和10 mM差異不顯著，但是20 mM的SNP處理抑制芽的伸長，甚至引起幼苗的死亡，因此10 mM SNP是打破杜梨種子休眠較合適濃度。

圖1 不同濃度SNP對杜梨種子休眠的影響Fig.1 Effect of different concentrations of SNP on the dormancy of Pyrus betulifolia seeds

2.2 PTIO在打破杜梨種子休眠中的作用

為了驗證NO在打破杜梨種子休眠中的作用，觀察了NO清除劑PTIO處理種子的萌發(fā)實驗，與SNP處理進行對比，結果如圖2。經過SNP處理杜梨種子在培養(yǎng)過程中迅速萌發(fā)，萌發(fā)率有較大提高，并與對照有極顯著差異。在生長上與對照相比，幼根明顯伸長，子葉增大變綠。同樣培養(yǎng)條件下，200 μM的NO清除劑PTIO處理使杜梨種子的萌發(fā)率始終低于對照，14 d時的萌發(fā)率僅有15.6%，與對照(21.1%)差異達到顯著水平(P＜0.05)，說明打破杜梨種子休眠需要NO參與。經10 mM SNP和200 μM PTIO共同處理14 d時的發(fā)芽率只有35.6%，與10 mM SNP單獨處理(55.7%)相比差異顯著(P＜0.05)?？梢奛O可以打破杜梨種子休眠，提高種子萌發(fā)率。

圖2 PTIO對杜梨種子休眠的影響Fig.2 Effect of PTIO on the dormancy of Pyrus betulifolia Bunge seeds

2.3 參與打破杜梨種子休眠的NO合成途徑

在植物體內NO的合成途徑包括NO合酶(NOS)途徑、硝酸還原酶(NR)途徑以及非酶促途徑。為了研究在打破杜梨種子休眠中，NOS途徑和NR途徑是否參與，用NOS抑制劑L-NAME和NR抑制劑Na2WO4處理杜梨種子，結果如圖3。從圖3可以看出經L-NAME單獨處理14 d時杜梨的萌發(fā)率僅僅是15.6%，為對照(22.2%)的70%，差異達到顯著水平(P＜0.05)，可見NOS途徑參與杜梨種子休眠的打破。經Na2WO4單獨處理的種子在培養(yǎng)過程中的萌發(fā)率和對照相近，至第14天時的萌發(fā)率是23.3%與對照(22.2%)沒有顯著差別?？梢奛R途徑沒有參與杜梨種子休眠的打破。

3 討論

圖3 L-NAME和NA2WO4對杜梨種子休眠的影響Fig.3 Effect of L-NAME and Na2WO4on the dormancy of Pyrus betulifolia seeds

不同物種之間種子的休眠情況差別很大，習慣上把萌發(fā)率大于80%作為種子休眠打破的標志，也有的人以50%的萌發(fā)率作為標準［13］。種子休眠的原因多種多樣，杜梨種子休眠是因為種子沒有完成后熟。NO是近年研究比較多的氣態(tài)小分子，大量的研究表明NO作為信號分子在植物生長發(fā)育和脅迫反應中起著重要作用。NO打破種子休眠促進種子萌發(fā)的報道也不少，但這些研究主要集中在需光種子的休眠方面，如NO可以代替光照打破泡桐［14］、擬南芥［15］和萵苣［16］等種子的休眠促進萌發(fā)，這表明NO作為信號分子能夠打破光敏色素調節(jié)的休眠。SNP處理對黃色羽葉豆種子的萌發(fā)也有明顯的促進作用，羽葉豆種子既沒有休眠也不是需光種子［17］。2006年Zhang等發(fā)現(xiàn)在小麥種子萌發(fā)的早期階段NO可以迅速增加β-淀粉酶的活性從而促進小麥種子的萌發(fā)［18］。可以看出NO在種子休眠和萌發(fā)中的作用似乎具有普遍性。2007年Agnieszka Gniazdowska等發(fā)現(xiàn)NO可以打破去皮的蘋果種子的休眠，促進它的萌發(fā)［6］。杜梨和蘋果同屬薔薇科植物，親緣關系比較近，NO在杜梨種子中是不是也有同樣的效果?本實驗的結果證實了這一猜想。

從圖1可以看出，不同濃度的SNP處理都有打破杜梨種子休眠的效應，并且表現(xiàn)為濃度依賴性，濃度越高萌發(fā)率越高，比如10mM SNP處理14 d時的萌發(fā)率可以達到56.7%，而5 mM SNP處理14 d時萌發(fā)率只有41.1%。NO不是SNP唯一的水解產物，為了確定打破杜梨種子休眠中是否NO在起作用，我們進行了藥理學實驗(圖2)。在SNP的處理中加入NO清除劑PTIO處理后，可以逆轉SNP的作用，14 d后只有35.7%種子萌發(fā)，與SNP單獨處理相比差異顯著。PTIO可以維持杜梨種子休眠抑制萌發(fā)，經PTIO單獨處理14 d時種子的發(fā)芽率只有15.7%，與對照(21.1%)也有明顯的差異。從實驗結果我們可以得出結論NO可以打破杜梨種子休眠。

植物中NO的產生途徑研究已經進行了20多年，前人研究表明，植物體內NO來源可能有3個:NOS途徑、NR途徑和非酶促合成途徑。Ninnemann和Maier(1996)第一次明確闡述了豆科植物可以通過 NOS途徑合成 NO［19］。隨后的研究證明玉米［20，21］、擬南芥［22，23］、煙草［24］等許多植物中都存在NOS途徑和NR途徑。但是植物通過哪條合成途徑調控種子休眠至今未見報道，Caro和 Pun-tarulo在1999年曾觀察到在大豆種子的 NOS活性隨萌發(fā)進程深入而上升［25］，這似乎暗示了在種子萌發(fā)過程中存在NOS合成途徑。本實驗中(圖3)分別用200 μM的L-NAME和10mM的Na2WO4處理杜梨種子來研究NO通過哪條途徑來調控種子休眠。圖3表明L-NAME單獨處理可以抑制杜梨種子萌發(fā)，14 d時種子的萌發(fā)率是15.7%，與對照(22.2%)差異顯著。而Na2WO4處理效果不顯著，14d時發(fā)芽率是23.3%與對照沒有顯著差異。結果證明在杜梨種子休眠打破時，NO的來源可能是通過NOS途徑，而不是通過NR途徑合成的。

由此可以得出結論:外源NO可以打破杜梨種子休眠，顯著提高萌發(fā)率，其中10 mM是SNP處理的最佳濃度。在打破杜梨種子休眠中，NO合成有一氧化氮合酶(NOS)途徑而沒有硝酸還原酶(NR)途徑參與。

［1］Wendehenne D，Durner J，Klessig DF.Nitric oxide:A new player in plant signalling and defence responses.Curr Opin Plant Biol，2004，7(4):449～455.

［2］Crawford NM，Guo FQ.New insights intonitric oxide metabolism and regulatory functions.Trends Plant Sci，2005，10(4):195～200.

［3］Lamotte O，Courtois C，Barnavon L，et al.Nitric oxide in plants:The biosynthesis and cell signalling properties of a fascinating molecule.Planta，2005，221(1):1～4

［4］Bethke P C，Badger M R，Jones R L.Apoplastic synthesis of nitric oxide by plant tissues［J］.Plant Cell，2004，16(2):332～ 341.

［5］Gautam Sarath，Guichuan Hou，Lisa M.Baird.Reactive oxygen species，ABA and nitric oxide interactions on the germination of warm-season C4-grasses［J］.Planta，2007，226:697～ 708.

［6］Agnieszka Gniazdowska，Urszula Dobrzyjska.Breaking the apple embryo dormancy by nitric oxide involves the stimulation of ethylene production［J］.Planta，2007，225:1051～1057.

［7］Delledonne M，Xia YJ，Dixon RA，Lamb C.Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance［J］.Nature，1998，394(6693):585～588.

［8］Durner J，Wendehenne D，Klessig D F.Defense gene induction in tobacco by nitric oxide，cyclic GMP，and cyclic ADP ribose［J］.Proc NatlAcad Sci USA，1998，95:10328～10333.

［9］Ninnemann H，Maier J.Indication for the occurrence of nitric oxide synthase in fungi and plants and the involvement in photoconidiation of Neurospora crassa［J］.Photo-chemistry and Photobiology，1996，64:93～398.

［10］Dean J，Harper J.Nitric-oxide and nitrous oxide production by soybean and winged bean during the in vivo nitrate reductase assay［J］.Plant Physiol，1986，82(3):718～ 723.

［11］Klepper L.Nitric-oxide emissions from soybean leaves during in vivo nitrate reduc-tase assays［J］.Plant Physiol，1987，85:96～99.

［12］Bethke PC，Badger MR，Jones RL.Apoplastic synthesis of nitric oxide by plant tissues［J］.Plant Cell，2004，16(2):332～ 341.

［13］胡晉.種子生物學［M］.高等教育出版社，2006，1:126～140.

［14］Grubisic D，Giba Z，Konjevic R.The effect of organic nitrates in phytochrome controlled germination of Paulownia tomentosa seeds［J］.Photochem Photobiol，1992，56:629～632.

［15］Lindermayr C，Saalbach G，Bahnweg G，et al.Differential inhibition of Arabidopsis methionine adenosylt ransferases by protein Snit rosylation［J］.Biol Chem，2006，281(7):4285～ 4291.

［16］C.Nicolás，G.Nicolás，D.Rodríguez，Antagonistics effects of ABA and gibberellic acid on the breaking of dormancy of Fagus sylvatica，Physiol［J］.Plant，1996，96:244～250.

［17］Krystyna Oracz1，et al.Release of sunflower seed dormancy by cyanide:cross-talk with ethylene signalling pathway［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59(8):2241～2251.

［18］Crawford NM，Guo FQ.New in sights into nitric oxide metabolism and regulatory functions［J］.Trends Plant Sci，2005，10(4):195～200.

［19］Ninnemann H，Maier J.Indication for the occurrence of nitric oxide synthase in fungi and plants and the involvement in photo conidiation of Neurospora crassa［J］.Photochemistry Photobiology，1996，64(2):393～398.

［20］Ribeiro E A，Cunha F Q，Tamashiro W，Martins I S.Growth phase-dependent subcellu-lar localization of nitric oxide synthase in maize cells［J］.FEBS Letters，1999，445(2～ 3):283～ 286.

［21］Leubner-Metzger G，Petruzzelli L，Waldvogel R，V?geli-Lange R，MeinsF.Ethylene responsive elementbinding protein(EREBP)expression and the transcriptional regulation of class I b-1，3-glucanase during tobacco seed germination［J］.Plant Mol Biol，1998，38:785～795.

［22］Guo FQ，Okamoto M，Crawford NM.Identification of a plant nitric oxide synthase gene involved in hormonal signaling［J］.Sence，2003，302(5642):100～103.

［23］Tun NN，et al.Polyamines induce rapibiosynthesis of nitric oxide(NO)in Athaliana seedlings［J］.Plant and Cell Physiology，2006，47(3):346～354.

［24］Chandok MR，et al.The pathogen-inducible nitric oxide synthase(iNOS)in plants is a variant of the P protein of the glycine decarboxylase complex［J］.Cell，2003，113(4):469～ 482.

［25］A.P.Calvo，C.Nicolás，O.Lorenzo，G.Nicolás，D.Rodríguez，Evidence for positive regulation by gibberellins and ethylene of ACC oxidase expression and activity during transition from dormancy to germination in Fagus sylvatica L.seeds［J］.Plant Growth Reg，2004，23:44～53.