金磊，劉萍，李海星，柯穎笑，孫麗婷，劉曉華

1(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌，330047)

2(揚(yáng)州市第一人民醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州，225009)

隨著人們生活水平的提高，乳品的需求量也日益增多。生產(chǎn)高品質(zhì)、多類型乳制品是乳品企業(yè)開(kāi)拓市場(chǎng)、促進(jìn)消費(fèi)的重要途徑。設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有特定功能的乳制品已成為一大研究熱點(diǎn)［1－2］。共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一組十八碳共軛二烯酸的總稱，包含多種位置和幾何異構(gòu)體。研究表明，CLA的特定異構(gòu)體具有促進(jìn)健康的保健功能，如抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增強(qiáng)肌體免疫力、調(diào)節(jié)脂肪代謝及促進(jìn)骨組織代謝等［3］。乳及乳制品是膳食中天然CLA的最主要來(lái)源，但是每100 mL牛奶中CLA的含量通常小于10 mg［4］，人們每天通過(guò)飲食攝入的CLA量與其能在體內(nèi)產(chǎn)生顯著保健功效的需要量(3 g/d)仍有較大差距。因此，如何從食物中獲取更多的CLA來(lái)滿足人體健康的需要，正受到人們的重點(diǎn)關(guān)注［5］。

有研究報(bào)道指出，增加食物中CLA含量的方法有兩種:一是通過(guò)改變飼料配方和飼養(yǎng)方法，提高畜產(chǎn)品中CLA的含量;另一種方法是在食品中，尤其是在乳制品中，進(jìn)行 CLA 的強(qiáng)化，提高 CLA 的含量［6－7］。因此，本研究通過(guò)在脫脂乳中添加亞油酸，利用乳酸菌發(fā)酵使其轉(zhuǎn)化成CLA，在保證酸奶特征指標(biāo)的同時(shí)，獲得富含CLA的新型保健功能酸奶產(chǎn)品。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

脫脂乳粉(黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)有限公司)，亞油酸(自制，純度＞95%)，植物乳桿菌R6(本實(shí)驗(yàn)室分離保藏)，乙醇、NaOH、正己烷均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)字黏度計(jì)(SNB-2)，上海尼潤(rùn)智能科技有限公司;電子天平(MP-500B)，上海天平總廠;電熱恒溫水浴鍋(HH-SH-4)，北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;堿式滴定管，離心機(jī)(TGL-16G)，上海安亭科學(xué)儀器廠;恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;液相色譜儀(1200)，美國(guó)安捷倫。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將植物乳桿菌R6菌種從甘油管中取出，轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)后作為發(fā)酵菌種。

1.3.2 酸奶的制備

將脫脂乳粉加水配制成10%的脫脂乳，每試管5 mL，85℃滅菌30 min，冷卻至合適的溫度接入植物乳桿菌R6菌種，接種量為體積分?jǐn)?shù)5%。然后分別向每組試管中加入0.025%、0.05%、0.075%、0.1%、0.125%亞油酸，混合均勻，放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了5個(gè)亞油酸添加量(0.025%、0.05%、0.075%、0.1%和0.125%)，每組分別發(fā)酵24、36、48 和 60 h。

1.3.4 黏度的測(cè)定

用SNB-2數(shù)字黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，選用4號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速60 r/min，重復(fù)測(cè)定叁3次取平均值。

1.3.5 滴定酸度的測(cè)定

取1 mL酸奶于小燒杯中并加入3 mL蒸餾水，加入1滴1%的酚酞做指示劑，用0.01 mol/L NaOH溶液準(zhǔn)確滴定，記錄消耗NaOH溶液的體積。通過(guò)計(jì)算測(cè)得酸奶的滴定酸度，用吉爾涅爾度(°T)表示［8］。

1.3.6 保水性的測(cè)定

稱取約3.50 g(記為W)酸奶于離心管中，以3 000×g離心20 min后，吸除上清液，稱殘余物的質(zhì)量(記為W1)［9］。

1.3.7 乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

取待測(cè)酸奶100 μL于1.5 mL離心管中，加入900 μL無(wú)菌水，混合均勻，依此方法做梯度稀釋，然后取100 μL涂布MRS平板，放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.8 MRS培養(yǎng)基的配制

大豆蛋白胨5 g，胰蛋白胨5 g，牛肉粉10 g，酵母粉5 g，葡萄糖 5 g，乙酸鈉 5 g，檸檬酸二胺 2 g，K2HPO42 g，土溫 80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.2 g，Mn-SO4·H2O 0.05 g，加蒸餾水至 1 L，調(diào)節(jié) pH 至6.8［10］。向上述液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15 g即得MRS固體培養(yǎng)基。

1.3.9 CLA的分析測(cè)定

CLA含量的測(cè)定采用高效液相色譜法，色譜柱為ChromSpher 5 Lipids(Chrompack)，流動(dòng)相為V(正己烷)∶V(乙腈)=99.9∶0.1，流量為 1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。CLA異構(gòu)體的確定采用毛細(xì)管電泳法［11］。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶黏度的影響

亞油酸是植物乳桿菌R6合成CLA的底物，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在脫脂奶中添加不同濃度的亞油酸，研究其對(duì)酸奶黏度的影響。由圖1可見(jiàn)，當(dāng)脫脂奶中的亞油酸添加量為0.025% ～0.075%時(shí)，酸奶黏度隨亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間呈逐漸上升趨勢(shì)，最大黏度值達(dá)2 950 mPa·s。而當(dāng)亞油酸添加量在 0.1% ～0.125%時(shí)，酸奶黏度卻逐漸下降，最低值為2 550 mPa·s。有研究表明，亞油酸對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有抑制作用［12］。本研究發(fā)現(xiàn)脫脂奶中的蛋白質(zhì)能使乳酸菌免受低濃度亞油酸的抑制作用，但當(dāng)亞油酸濃度超過(guò)0.1%時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)仍然會(huì)受到一定程度的抑制，從而出現(xiàn)酸奶黏度下降的現(xiàn)象。

圖1 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶黏度的影響Fig.1 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on viscosity of yogurt

酸奶在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌會(huì)將乳糖轉(zhuǎn)化成乳酸，當(dāng)pH值降至酪蛋白的等電點(diǎn)時(shí)，牛奶中的酪蛋白開(kāi)始凝結(jié)，形成具有立體結(jié)構(gòu)的凝膠體系，呈現(xiàn)酸奶特有的黏稠質(zhì)地。酸奶的酸度和蛋白水解程度等對(duì)酸奶的黏度影響較大，同時(shí)乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物如胞外多糖與酪蛋白的相互作用也會(huì)對(duì)酸奶的黏度產(chǎn)生影響［13］。酸奶的黏度在感官上主要表現(xiàn)為稠厚感，較大的黏度可增強(qiáng)酸奶的穩(wěn)定性，防止乳清析出［14］。通過(guò)測(cè)定黏度，本研究也發(fā)現(xiàn)隨著酸奶黏度的增加，其乳清的析出相應(yīng)減少。

2.2 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶酸度的影響

酸奶的總酸度是衡量其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，在酸奶發(fā)酵過(guò)程中，隨著乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，乳酸不斷在酸奶中累積，總酸度隨發(fā)酵時(shí)間的增加而增大［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵24 h的酸奶酸度較低，在66～75°T之間，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，酸奶酸度逐漸升高，最高達(dá)到115°T(圖2)。以發(fā)酵36 h的酸奶為例，當(dāng)亞油酸添加量在0.025% ～0.125%時(shí)，酸奶的酸度為75～85°T，整體變化趨勢(shì)比較平緩，表明亞油酸濃度對(duì)酸奶酸度的影響較小。

消費(fèi)者對(duì)酸奶酸度選擇范圍較廣，一般為80～130°T。目前，酸奶普遍采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌株發(fā)酵，由于菌體生長(zhǎng)快、產(chǎn)酸高，為獲得較好的口感，通常只發(fā)酵6 h即進(jìn)入冷藏后發(fā)酵。鑒于本研究中添加了亞油酸，菌體生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)為了提高酸奶中CLA的含量，發(fā)酵時(shí)間比傳統(tǒng)生產(chǎn)方法有所延長(zhǎng)。發(fā)酵36 h酸奶的酸度為75～85°T，酸度適宜，符合消費(fèi)者的喜好和要求。此外，有報(bào)道酸奶在貯存過(guò)程中酸度會(huì)越來(lái)越高，即出現(xiàn)后酸化現(xiàn)象［16］。本研究將發(fā)酵后的酸奶4℃冷藏7 d，未見(jiàn)酸度顯著升高，這可能是在前發(fā)酵時(shí)乳糖已被植物乳桿菌R6充分利用所致。

圖2 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶酸度的影響Fig.2 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on acidity of yogurt

2.3 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶保水性的影響

乳清析出、凝乳不結(jié)實(shí)是凝固型酸奶中普遍存在的產(chǎn)品缺陷之一。Lucey等研究了乳蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)，指出乳清析出可能和酸奶的蛋白凝膠有很大關(guān)系［17－18］。酸奶的保水性與酸奶中的乳清析出和凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度有關(guān)，保水性是評(píng)價(jià)酸奶穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究了亞油酸添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶保水性的影響。由圖3可見(jiàn)，亞油酸添加量對(duì)酸奶的保水性影響較小，而發(fā)酵時(shí)間對(duì)保水性的影響較大。發(fā)酵36 h以上時(shí)，不同亞油酸添加量酸奶的保水性均在43%～52%之間，符合產(chǎn)品的質(zhì)量要求。而當(dāng)只發(fā)酵24 h時(shí)，酸奶的保水性最高僅為35%，這可能是由于發(fā)酵時(shí)間偏短，產(chǎn)酸偏少導(dǎo)致脫脂乳中酪蛋白凝結(jié)不充分所引起。

圖3 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶保水性的影響Fig.3 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on water retention of yogurt

2.4 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶活菌數(shù)的影響

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽(yáng)性菌，是一種人體益生菌。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌有降膽固醇、降血壓和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種保健作用，因此乳酸菌也常被作為益生菌添加在酸奶中［19］。國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布的酸乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，乳酸菌數(shù)不得低于1×106CFU/mL。由此可見(jiàn)，酸奶中的乳酸菌數(shù)已被列入國(guó)家強(qiáng)制檢測(cè)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酸奶中亞油酸添加量在0.025%～0.075%時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)呈逐漸上升趨勢(shì)，而當(dāng)亞油酸添加量為0.1% ～0.125%時(shí)，活菌數(shù)逐漸降低(圖4)。以發(fā)酵36 h的酸奶為例，亞油酸添加量在0.025% ～0.075%時(shí)，活菌數(shù)從4.4×108CFU/mL上升到5.7×108CFU/ML，而當(dāng)亞油酸添加量從0.1%增加至0.125%時(shí)，活菌數(shù)從5.7×108cfu/mL下降到3.3×108CFU/mL。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是當(dāng)亞油酸添加量高于0.1%，會(huì)對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著抑制作用。本研究中乳酸菌活菌數(shù)均高于2.0×108CFU/mL，符合酸乳國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶活菌數(shù)的影響Fig.4 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on number of viable count of yogurt

2.5 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶中CLA含量的影響

CLA在2009年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，可以直接服用或者添加到各種乳制品中。它具有顯著的抗腫瘤、降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、增加肌肉、提高免疫力、防治糖尿病等多種重要的生理功能［20－21］。在美國(guó)，CLA 早已被開(kāi)發(fā)成減肥保健品。植物乳桿菌R6是本實(shí)驗(yàn)室從牛瘤胃中分離到的具有生物合成CLA的菌株，鑒于CLA的諸多保健功能，本研究在脫脂奶中添加亞油酸，通過(guò)乳酸菌發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)富含CLA的酸奶。

由圖5可見(jiàn)，隨著亞油酸添加量的增加，酸奶中生成的CLA的含量總體呈上升趨勢(shì)。當(dāng)亞油酸添加量為0.125%時(shí)，亞油酸的轉(zhuǎn)化率卻比0.1%時(shí)略低，這可能是高濃度亞油酸抑制了菌體生長(zhǎng)，造成亞油酸異構(gòu)酶比活性降低所致。當(dāng)脫脂乳中亞油酸添加量為0.1%，發(fā)酵36 h時(shí)，酸奶CLA的含量達(dá)到0.9 mg/mL。通過(guò)毛細(xì)管電泳方法對(duì)酸奶中的CLA進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)其主要成分為c9，t11-CLA(峰1)，含量大于75%(圖6)。Lin等報(bào)道了幾種乳酸菌具有將亞油酸轉(zhuǎn)化為CLA的能力，包含c9，t11-CLA和t10，c12-CLA兩種異構(gòu)體，表明乳酸菌具有選擇性合成CLA異構(gòu)體的特點(diǎn)［22］。本研究通過(guò)植物乳桿菌R6單菌株發(fā)酵可以獲得富含CLA的酸奶，為縮短發(fā)酵時(shí)間，還需對(duì)植物乳桿菌R6與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。

圖5 亞油酸濃度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶中CLA含量的影響Fig.5 Effect of the concentration of linoleic acid and fermentation time on the content of CLA of yogurt

圖6 酸奶中CLA的毛細(xì)管電泳色譜圖Fig.6 Chromatography of CLA in yogurt by capillary electrophoresis

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定發(fā)酵酸奶的黏度、酸度、保水性、活菌數(shù)和CLA的含量，本研究發(fā)現(xiàn)向脫脂奶中添加亞油酸，利用乳酸菌發(fā)酵可以生產(chǎn)富含CLA的新型酸奶。通過(guò)植物乳桿菌R6單菌株發(fā)酵，可獲得品質(zhì)優(yōu)良的酸奶產(chǎn)品，其中CLA的含量高達(dá)0.9 mg/mL，遠(yuǎn)高于天然食物中的含量。本研究所得的新產(chǎn)品將酸奶的營(yíng)養(yǎng)與CLA的保健功能集于一體，既豐富了酸奶的品種，也提高了酸奶的保健功能，滿足了人們對(duì)高品質(zhì)產(chǎn)品的需求。

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