陳文強，喬艷明（.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

響應(yīng)面法在香菇液體種生產(chǎn)工藝優(yōu)化中的應(yīng)用

陳文強1，2，喬艷明1
（1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000）

以香菇菌絲體生物轉(zhuǎn)化量為主要指標，首先用單因素實驗篩選出適合香菇南山1號菌絲生長的最佳碳、氮源，在此基礎(chǔ)上利用Minitab 15軟件做Plackett-Burman設(shè)計實驗，篩選出對菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響顯著的因子：玉米粉、麥麩、MgSO4·7H2O和接種量；然后進行最陡爬坡實驗，選出最佳響應(yīng)區(qū)域，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken模式做4因素3水平響應(yīng)面分析實驗，得到最優(yōu)的液體種生產(chǎn)工藝條件：玉米粉36.0 g、麥麩21.0 g、紅糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L，初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180 r/min搖床發(fā)酵10 d，此條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量可達51.004 g/L。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。說明響應(yīng)面法用于香菇液體菌種生產(chǎn)優(yōu)化是可行的，數(shù)學模型的預測值與實驗觀察值相符。

香菇，液體種，響應(yīng)面，優(yōu)化

香菇（Lentinus edodes）隸屬于擔子菌綱、傘菌目、口蘑科、香菇屬，又名香菇菌、花菇、花蕈等，是一種重要的真菌［1］。香菇含有豐富的人體必需氨基酸，不飽和脂肪酸比重大，并且含有6大酶類中的40多種酶［2］。其不僅是人們理想的美味佳肴，而且具有較高的營養(yǎng)價值，其保健藥用功能也越來越受到人們的重視［3-6］。

近年來，液體深層發(fā)酵技術(shù)用于食用菌液體種的生產(chǎn)和制備，越來越受到人們重視［7-8］，是由于該技術(shù)比之傳統(tǒng)的食用菌生產(chǎn)方法有明顯的優(yōu)越性［9］。因為此技術(shù)在短期內(nèi)就能獲得大量的菌絲體或菌種，液體菌種接入固體培養(yǎng)料時，又具有流動快，易分散，萌發(fā)快，發(fā)菌點多等特點，使袋栽食用菌接種污染得到有效的控制。因此，食用菌研究工作者認為深層發(fā)酵生產(chǎn)是食用菌發(fā)展的方向［10-11］。香菇作為食用菌生產(chǎn)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，其液體種的生產(chǎn)工藝是提高香菇生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。

目前，響應(yīng)面法在其液體種生產(chǎn)工藝條件優(yōu)化中的應(yīng)用方面尚無研究報道，并且由于菌種和培養(yǎng)條件等因素的差異，所得到香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量差別較大。張安寧等［12］對香菇933菌株液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化實驗，所得菌絲生物轉(zhuǎn)化量僅為17.76 g/L。梁寶東等［13］采用正交實驗對香菇856菌株培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，所得菌絲生物轉(zhuǎn)化量為78.4 g/L。

本研究采用香菇南山1號菌株為材料，在單因素實驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對香菇液體種的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，旨在為香菇液體種的工業(yè)化制備和生產(chǎn)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

香菇南山1號菌株陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供；葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4NO3均為分析純；VB1山西津華暉星制藥有限公司；瓊脂、牛肉粉、酵母粉、蛋白胨北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；麥芽糖中國科學院上海生物化學研究所；麥麩、紅糖、蔗糖、玉米粉（均為食品級）市售；實驗用水為純化水；斜面培養(yǎng)基（CPDA） 土豆（去皮）200.0 g、葡萄糖20.0 g、KH2PO45.0 g、MgSO4·7H2O 3.0 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L、瓊脂12.0 g、初始pH自然；母種培養(yǎng)基牛肉粉10.0 g、麥麩10.0 g、紅糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L、初始pH自然；碳源篩選培養(yǎng)基葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、紅糖各為20.0 g，玉米粉10.0 g、酵母粉2.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB110.0 mg、初始pH自然；氮源篩選培養(yǎng)基酵母粉、蛋白胨、牛肉粉、NH4NO3各為2.0 g，麥麩10.0 g、紅糖20.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB110.0 mg、初始pH自然。

LS-B50L型高壓蒸汽滅菌鍋上海醫(yī)用核子儀器廠；TB-214型電子分析天平北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司；MDF-U32V型超低溫冷凍冰箱日本三洋電器集團；Q/BKYY31-2000型電恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫(yī)療器械廠；LRH-250-GS型數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHWY-210 2C型數(shù)顯式恒溫搖床上海志成有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌株活化配制CPDA培養(yǎng)基，接種香菇南山1號菌株，28℃培養(yǎng)，待菌株滿管后，4℃冰箱保藏備用。

1.2.2液體母種的制備配制母種培養(yǎng)基，取香菇南山1號0.5 cm2菌塊接種于母種培養(yǎng)基中，靜置24 h，28℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)10 d備用。

1.2.3生物轉(zhuǎn)化量的測定將液體條件下培養(yǎng)好的香菇菌絲體抽濾至不滴水，電子分析天平稱重。計算式：菌絲球生物轉(zhuǎn)化量=香菇菌絲球濕重（g）/培養(yǎng)液總體積（L）

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1碳源篩選實驗在碳源篩選培養(yǎng)基中，用10.0 g玉米粉分別與麥芽糖、紅糖、蔗糖和葡萄糖各20.0 g組合作為碳源，配制培養(yǎng)基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24 h，28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)10 d，每種培養(yǎng)基3個重復，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳碳源組合作為Plackett-Burman設(shè)計考慮因素。

1.2.4.2氮源篩選實驗在氮源篩選培養(yǎng)基中，用10.0 g麥麩分別與酵母粉、蛋白胨、牛肉粉和NH4NO3各2.0 g組合作為氮源，配制培養(yǎng)基，將液體母種按照5%的接種量接種，靜置24 h，28℃、160 r/min條件下培養(yǎng)10 d，每種培養(yǎng)基3個重復，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，篩選出最佳氮源組合作為Plackett-Burman設(shè)計考慮因素。

1.2.5Plackett-Burman設(shè)計實驗根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取11個因素（紅糖、玉米粉、麥麩、牛肉粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1、初始pH、接種量、溫度、振蕩速度）作為研究對象，進行Plackett-Burman設(shè)計實驗，按照表1和表5配制培養(yǎng)基，接液體母種，靜置24 h，振蕩培養(yǎng)10 d，每組實驗設(shè)3個重復，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量，求平均值，借助Minitab 15軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6最陡爬坡實驗根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果，以及各個顯著影響因素效應(yīng)的大小設(shè)定步長及變化方向進行實驗。針對影響顯著因素進行最陡爬坡實驗，將正效應(yīng)的值逐步增加，負效應(yīng)的值逐步減小，設(shè)計實驗找出峰值，以尋找快速最佳的響應(yīng)區(qū)域。每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復，接種后靜置24 h，振蕩培養(yǎng)10 d，將菌絲球抽濾，測定菌絲生物轉(zhuǎn)化量。

表1　Plackett-Burman實驗設(shè)計各因素及水平Table 1　The factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.7Box-Behnken實驗設(shè)計與分析根據(jù)上述實驗，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量為響應(yīng)值，采用玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）進行四因素三水平的Box-Behnken實驗設(shè)計，因素與水平編碼見表2。

表2　Box-Behnken實驗設(shè)計Table 2　Box-Behnken experimental design

1.2.8數(shù)據(jù)處理與分析采用Minitab 15軟件和Excel數(shù)據(jù)分析工具中的t-檢驗（雙樣本異方差假設(shè)）對Plackett-Burman實驗結(jié)果進行分析，并采用Design-Expert 8.0.6軟件對Box-Behnken實驗結(jié)果進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1不同碳源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行實驗，觀察不同碳源對香菇菌絲生長的影響，結(jié)果見表3。

表3　不同碳源對香菇菌絲體生長的影響Table 3　Effect of different carbon source on the mycelial biomass of Lentinus edodes

表3結(jié)果表明，不同碳源對香菇菌絲體生長的生物轉(zhuǎn)化量不同，其中以紅糖和玉米粉組合最好，菌絲生物轉(zhuǎn)化量最高。以麥芽糖和玉米粉組合也顯現(xiàn)出較高的生物轉(zhuǎn)化量，葡萄糖和玉米粉組合的菌絲生物轉(zhuǎn)化量最低。根據(jù)不同碳源組合培養(yǎng)基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉(zhuǎn)化量，可確定紅糖與玉米粉組合為最佳碳源，菌絲生物轉(zhuǎn)化量為27.322 g/L。

2.1.2不同氮源對香菇菌絲體生長的影響按照1.2.4方法進行實驗，觀察不同氮源對香菇菌絲生長的影響，結(jié)果見表4。

表4　不同氮源對香菇菌絲體生長的影響Table 4　Effect of different nitrogen source on the mycelial biomass of Lentinus edodes

表4結(jié)果表明，不同氮源對香菇菌絲體生長的生物轉(zhuǎn)化量不同，其中以牛肉粉和麥麩組合最好，菌絲生物轉(zhuǎn)化量高。以酵母粉和麥麩組合作為氮源也顯現(xiàn)出較高的生物轉(zhuǎn)化量，NH4NO3和麥麩組合的菌絲生物轉(zhuǎn)化量最低。根據(jù)不同氮源組合培養(yǎng)基中香菇菌絲的生長狀況和生物轉(zhuǎn)化量，可確定牛肉粉與麥麩組合為最佳氮源，菌絲生物轉(zhuǎn)化量為30.343 g/L。

2.2Plackett-Burman設(shè)計實驗

選用實驗次數(shù)n=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計，考察X1（紅糖）、X2（玉米粉）等11個因素，根據(jù)前期實驗結(jié)果，每個因素取兩水平，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量Y為響應(yīng)值。同時借助Minitab 15軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，并通過t-檢驗從11個因素中選出了4個最顯著影響因素，結(jié)果見表5和表6。

表5　Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 5　Plackett-Burman experiment design and its response

表6　Plackett-Burman實驗方差分析結(jié)果Table 6　ANOVA results of Plackett-Burman experiment design

表5和表6結(jié)果表明，對香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響的顯著因素：玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）。其中，X2、X3和X11在增加的時候，菌絲生物轉(zhuǎn)化量的值明顯增加，為正效應(yīng)因素。而X6在量增多的時候，菌絲生物轉(zhuǎn)化量反而降低，因此X6為負效應(yīng)因素。

2.3最陡爬坡實驗

響應(yīng)面擬合只有在鄰近最大響應(yīng)區(qū)域后才能最好地反映出真實情況，故要先逼近最佳響應(yīng)區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman實驗結(jié)果，將玉米粉（X2）、麥麩（X3）和接種量（X11）的值逐步增加，MgSO4·7H2O（X6）的值逐步減小。根據(jù)Minitab 15軟件實驗分析，其他因素取高水平，結(jié)果見表7。

表7　最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果Table 7　Steepest ascent experimental design and results

表7結(jié)果表明，在玉米粉24.0 g/L，麥麩14.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.1 g/L，接種量14.0%時，測得香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量最大為29.214 g/L，所以此為最佳響應(yīng)區(qū)域。

2.4Box-Behnken實驗設(shè)計與分析

按照表2中因素水平，借助Design-Expert 8.0.6軟件進行四因素三水平Box-Behnken實驗設(shè)計，結(jié)果見表8。

表8　Box-Behnken中心組合因素水平編碼表Table 8　Independent variables and coded levels in Box-Behnken experimental design

2.5回歸模型方差分析結(jié)果

經(jīng)Design-Expert 8.0.6軟件，以玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）為響應(yīng)變量，以菌絲生物轉(zhuǎn)化量（Y）為響應(yīng)值對表8結(jié)果進行處理，得到表9回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性的二次多項式擬合，得到預測模型如下：

表9結(jié)果表明，X3、X6、X11、X2X11、X3X6、X62項顯著；X2項極顯著，其他X2X3、X2X6、X3X11、X6X11、X22、X32、X112不顯著。模型p值小于0.0001，可信度水平大于99.99%，說明該模型有意義，所擬合的二次回歸方程合適。該模型失擬項p值為0.3456＞0.05，失擬項不顯著，說明實驗操作可信，實驗理論可使用。另外從F值可看出這四個因素對菌絲生物轉(zhuǎn)化量的影響順序：X2＞X11＞X6＞X3，即玉米粉＞接種量＞MgSO4·7H2O＞麥麩。

2.6響應(yīng)面及等高值分析結(jié)果

根據(jù)回歸方程繪制菌絲生物轉(zhuǎn)化量隨各因素變化的響應(yīng)曲面圖，由響應(yīng)曲面圖可知玉米粉、麥麩、MgSO4·7H2O、接種量4個因素對香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量的影響（圖1、圖2）。每個響應(yīng)曲面分別代表著兩個獨立因素間的相互作用，其余兩個因素保持在編碼水平的0水平。

圖1結(jié)果顯示，在一定接種量條件下，隨著玉米粉含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較低條件下，隨著接種量的增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在玉米粉含量較高條件下，接種量對香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量影響不明顯。

圖2結(jié)果顯示，在低硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在高硫酸鎂含量條件下，隨著麥麩含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈下降趨勢；在低麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈上升趨勢；在高麥麩含量條件下，隨著硫酸鎂含量增加，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量呈下降趨勢。

在實際生產(chǎn)過程中，為了降低成本，盡可能使用有機廉價的原料，所以在“criteria”選項中選擇MgSO4·7H2O為最小值，玉米粉、接種量、麥麩為平均值，香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量為最大值，利用Design-Expert 8.0.6得到香菇南山1號菌株液體種的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件：玉米粉36.0 g、麥麩21.0 g、紅糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L，初始pH 6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180 r/min振蕩發(fā)酵10 d，菌絲生物轉(zhuǎn)化量擬合值為49.956 g/L。

表9　回歸分析結(jié)果Table 9　Result of regression analysis

圖1　菌絲生物轉(zhuǎn)化量在接種量和玉米粉交互影響下的響應(yīng)面以及等高值線圖Fig.1　Mycelial wet weight values of the response surface and contour charts in inoculation quantity and corn flour

圖2　菌絲生物轉(zhuǎn)化量在麥麩和MgSO4·7H2O交互影響下的響應(yīng)面以及等高值線圖Fig.2　Mycelial wet weight values of the response surface and contour charts in wheat bran and MgSO4·7H2O

2.7驗證實驗

根據(jù)最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件參數(shù)對模型進行驗證，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，最終得到香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量為51.004 g/L，在初始培養(yǎng)條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量為29.214 g/L，優(yōu)化后提高了1.75倍。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。該結(jié)果表明，響應(yīng)面法優(yōu)化香菇液體種最佳生產(chǎn)工藝條件是可行有效的。

3　結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析法對香菇南山1號菌株液體種生產(chǎn)工藝條件進行了優(yōu)化，并得到回歸方程，表明玉米粉（X2）、麥麩（X3）、MgSO4·7H2O（X6）、接種量（X11）對響應(yīng)值均有顯著影響，接種量和玉米粉、麥麩和MgSO4·7H2O交互作用顯著。經(jīng)回歸分析并結(jié)合生產(chǎn)實際，確定香菇南山1號菌株的液體種生產(chǎn)工藝條件為玉米粉36.0 g、麥麩21.0 g、紅糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO43.0 g、MgSO4·7H2O 0.6 g、VB110.0 mg、H2O 1.0 L、初始pH6.2、接種量7.0%、溫度29℃、180 r/min搖床發(fā)酵10 d，此條件下菌絲生物轉(zhuǎn)化量為51.004 g/L，比之前得到大幅度提高。實測值與擬合值相比，相對誤差約為2.098%。說明該模型可靠性較高，能很好地預測實驗結(jié)果。相比現(xiàn)有報道，本研究所得香菇菌絲生物轉(zhuǎn)化量較高，菌絲球小、密度大且大小均勻，同時生產(chǎn)工藝簡單且成本參考文獻

低，可為香菇南山1號菌株的液體種生產(chǎn)和栽培提供理論參考。

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Application of response surface for the optimization of liquid seed production process of Lentinus edodes

CHEN Wen-qiang1，2，QIAO Yan-ming1
（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong 723000，China）

Adopting mycelial biomass of Lentinus edodes（Berk.）Sing as major index，different carbon and nitrogen source on the L.edodes（‘Nanshan NO.1’）mycelial growth were used in the single factor test.The important factors influencing mycelial biomass of L.edodes which identified by initial experimental design of Plackett-Burman were corn flour，wheat bran，MgSO4·7H2O and inoculation quantity.The path of steepest ascent was undertaken to approach the optimal region of the four significant factors.Box-Behnken design and response surface analysis were adopted to further investigate the mutual interaction between the variables and obtain optimal values that bring the optimal L.edodes liquid seed production process conditions.The optimal conditions for L.edodes liquid seed production were achieved and listed as follows：corn flour 36.0 g，wheat bran 21.0 g，brown sugar 20.0 g，beef powder 4.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，VB110.0 mg，H2O 1.0 L，initial pH6.2，inoculation quantity 7.0%，temperature 29℃，agitation speed of rotary shaker 180 r/min，culture time 10 days.Under the optimal conditions，the mycelial biomass of L.edodes was 51.004 g/L，compared to the theoretical value，the relative error of 2.098%.So the response surface method was feasible for the optimization of liquid seed production process of L.edodes，and the predicted values of Mathematical model were consistent with experimental observations.

Lentinus edodes；liquid Seed；response surface；optimization

TS201.1

B

1002-0306（2015）18-0290-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.050

2015－01－04

陳文強（1956-），男，大學本科，教授，研究方向：微生物資源的保護與利用，E-mail：wenqiangc@126.com。

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程計劃項目﹙2008IDGC-04﹚。