霍建新，原慧艷，王　燕，王　演，白彩艷，趙文博*

（1.晉中學(xué)院，山西 晉中 030600；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

干酪乳清酶解產(chǎn)物抗氧化肽的分離和純化

霍建新1，原慧艷1，王燕1，王演1，白彩艷1，趙文博2，*

（1.晉中學(xué)院，山西 晉中 030600；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

干酪乳清Alcalase 2.4L酶解的最優(yōu)條件，即酶解時(shí)間為2 h、pH 9.5、酶與底物比為4%、酶解溫度為50 ℃。利用超濾、葡聚糖凝膠層析和三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，tricine SDS-PAGE）等方法從干酪乳清中提取抗氧化性蛋白肽。分別考察操作壓力、料液溫度、料液pH值、操作時(shí)間對(duì)超濾膜膜通量的影響。乳清酶解物超濾的最佳條件為：壓力0.25 MPa、溫度30 ℃、時(shí)間120 min、初始pH 9.0。分子質(zhì)量4 000～6 000 D肽的水解液脂質(zhì)過氧化抑制率最高，達(dá)到47.28%。利用Sephadex G-50型葡聚糖凝膠進(jìn)行純化，將分離的組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析和脂質(zhì)過氧化抑制率的測(cè)定。第34管洗脫液的脂質(zhì)過氧化抑制率最高，分子質(zhì)量范圍為4 000～4 100 D。

干酪乳清；超濾；堿性蛋白酶；抗氧化肽

乳清是干酪加工過程中排出的液體副產(chǎn)品，廉價(jià)易得。乳清蛋白通過酶解等方式釋放生物活性肽，尤其是抗氧化活性肽，可有效預(yù)防癌癥、老化、動(dòng)脈硬化等疾病［1］。Pe?a-Ramos等［2］研究認(rèn)為乳清蛋白酶解物可以抑制脂質(zhì)過氧化。劉志東等［3］研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的抗氧化活性機(jī)理是提供的氫原子還原氧自由基以及脂類的自動(dòng)氧化被半胱氨酸分解產(chǎn)生的巰基基團(tuán)抑制。

目前國內(nèi)外有關(guān)乳清蛋白酶解物的研究主要集中在其抗氧化活性及具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)的提取方面［3-4］。關(guān)于優(yōu)化乳清酶解工藝，分離純化抗氧化肽［5-9］，并確定肽的分子質(zhì)量范圍研究甚少。

本研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究干酪乳清Alcalase 2.4L酶解的最優(yōu)條件，利用超濾、葡聚糖凝膠層析等技術(shù)，進(jìn)行脂質(zhì)過氧化抑制率測(cè)定，從干酪乳清水解產(chǎn)物提取抗氧化性肽。采用分離小分子肽的三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，tricine-SDS-PAGE）方法確定肽的分子質(zhì)量，制備抗氧化肽產(chǎn)品，不僅減少環(huán)境污染，也可帶來經(jīng)濟(jì)效益。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮干酪乳清，天津科技大學(xué)干酪科學(xué)與工程研究室提供。

Alcalase 2.4L堿性蛋白酶（酶活力87 170 U/g）北京諾和諾德生物制劑有限公司；Tris 美國Sigma公司；卵磷脂 天津市英博生化試劑有限公司；G-50葡聚糖凝膠 美國Pharacia公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；BS-100型部分收集器 上海滬西分析儀器廠；層析柱（φ16 cm× 40 cm） 北京來亨科貿(mào)公司；5804R型高速低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；752紫外-可見分光光度計(jì) 天津市普瑞斯儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；超濾裝置（超濾膜截留分子質(zhì)量分別為2 000、4 000、6 000 D） 上海斯納普膜分離科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國Thermo Electron公司。

1.3方法

1.3.1干酪乳清的前處理

1.3.1.1乳清的脫脂

乳清在離心力為8 000×g、4 ℃條件下離心20 min，去除上層的脂肪待用。

1.3.1.2乳清濃縮

乳清經(jīng)雙層紗布過濾，除去大塊固形物，在60 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮乳清，當(dāng)旋出乳清的體積為原乳清體積的約2/3停止。然后將乳清進(jìn)行過濾、離心，用2 000 D的超濾膜進(jìn)行超濾，將截留液收集。

1.3.2乳清酶解液的制備

新鮮乳清濃縮液，通過酶解溫度、酶解時(shí)間、酶與底物比（［E］/［S］）、pH值為考察因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以水解度作為優(yōu)化指標(biāo)。固定酶解溫度55 ℃，pH 8.5，酶與底物比為4%，考察酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響，得到最佳酶解時(shí)間。固定pH 8.5，酶與底物比為4%，最佳酶解時(shí)間，考察酶解溫度對(duì)水解度的影響，得到最佳酶解溫度。固定最佳酶解溫度，酶與底物比為4%，最佳酶解時(shí)間，考察pH值對(duì)水解度的影響，得到最佳pH值。固定最佳酶解溫度、pH值、酶解時(shí)間，考察不同酶與底物比對(duì)水解度的影響，得到最佳酶與底物比。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最佳酶解條件。調(diào)節(jié)溶液pH值、溫度、Alcalase 2.4L酶與底物比，啟動(dòng)水解反應(yīng)。反應(yīng)過程中用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)液使pH值保持恒定。酶解一定時(shí)間后，85 ℃維持15 min進(jìn)行酶滅活。蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定用pH-Stat法［10］。

1.3.3乳清肽的超濾分離

乳清酶解液通過截留分子質(zhì)量為6 000 D的超濾膜，收集透過液，將其通過截留分子質(zhì)量為4 000 D的超濾膜，收集各個(gè)分子質(zhì)量段的乳清酶解液。固定料液溫度30 ℃，pH 9.0，120 min為一個(gè)運(yùn)行周期，測(cè)定不同操作壓力（0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 MPa）的膜通量，得到最佳操作壓力；固定最佳操作壓力，pH 9.0，120 min為一個(gè)運(yùn)行周期，測(cè)定不同料液溫度（15、20、25、30、35、40 ℃）的膜通量，得到最佳料液溫度；固定最佳料液溫度和操作壓力，pH 9.0，測(cè)定不同操作時(shí)間（20、40、60、80、100、120、140、160、180 min）的膜通量，得到最佳的運(yùn)行周期；固定最佳料液溫度、操作壓力、一個(gè)運(yùn)行周期的值，測(cè)定pH值（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10）的膜通量，確定最佳pH值。膜通量由公式（1）計(jì)算可得［11］。

式中：J為膜通量/（L/（m2·h））；V為透過液的體積/L；S為超濾膜的有效面積/m2；t為超濾所消耗的時(shí)間/h。

1.3.4抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定［12-13］

酶解液離心、超濾，選取未進(jìn)行超濾的乳清酶解液、分子質(zhì)量大于6 000 D酶解液、分子質(zhì)量在4 000～6 000 D之間酶解液以及分子質(zhì)量低于4 000 D酶解液。超濾液在-55 ℃條件下冷凍干燥24 h，冷阱溫度-50 ℃，真空度為50 kPa。測(cè)定其抗脂質(zhì)過氧化活性。

依次加入1 mL卵磷脂溶液、1 mL 400 mmol/L FeCl3溶液、1 mL樣品于10 mL試管。然后將1 mL 400 mmol/L抗壞血酸加入。將其混勻后避光，置于37 ℃恒溫水浴箱1 h，接著加入三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）-HCl混合溶液2 mL，置于90～100 ℃水浴箱15 min，取出后將其快速冷卻，2 000×g離心10 min，取上清液在535 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。在空白管中加入1 mL重蒸水，代替樣品，按上述操作方法，測(cè)定吸光度（A0）。脂質(zhì)過氧化抑制率計(jì)算公式如下。

1.3.5乳清中抗氧化肽的粗提

取抗氧化性活力高的分子質(zhì)量段的超濾液，使用葡聚糖凝膠層析技術(shù)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行粗提。選用Sephadex G-50，蛋白分離范圍1 500～30 000 D。煮沸葡聚糖凝膠，用pH 7.0，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗，使上層溶液干凈透明，裝柱。上樣1 mL經(jīng)超濾處理的酶解液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液洗脫后，流速為0.6 mL/min，洗脫液為蒸餾水，每管收集時(shí)間為5 min，收集的樣品于280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.6三羥甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，tricine-SDS-PAGE）

Tricine-SDS-PAGE的分離膠采用4 mL 5C凝膠儲(chǔ)存液、4 mL凝膠緩沖液（3×）、4.32 mL尿素配成，臨用前加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的過硫酸銨溶液60 μL和四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）6 μL［14-16］。濃縮膠用凝膠緩沖液（3×）1.86 mL、3C凝膠儲(chǔ)存液0.6 mL和2.54 mL去離子水配成，臨用前加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%過硫酸銨溶液50 μL和TEMED 5 μL。正極緩沖液（5×）：取Tris 60.57 g，HCl調(diào)pH 8.9，用去離子水定容到250 mL；負(fù)極緩沖液（10×）：取Tricine 8.958 g，Tris 6.055 g，SDS 0.5 g，加入去離子水，定容至50 mL。整塊分離膠浸沒在考馬斯亮藍(lán)R250溶液（0.25%）中，染色3 h。取出并用水漂洗3 次后，加入脫色液，脫色液根據(jù)脫色情況更換，脫去凝膠藍(lán)色背景，直至蛋白質(zhì)色帶清晰顯現(xiàn)［17-18］。

1.3.7抗氧化肽制備

樣品經(jīng)純化后，再經(jīng)濃縮，冷凍干燥，即為抗氧化肽樣品。

2　結(jié)果與分析

2.1Alcalase 2.4L蛋白酶酶解干酪乳清條件的確定

2.1.1酶解時(shí)間對(duì)酶解液水解度的影響

圖1　酶解時(shí)間對(duì)干酪乳清酶解液水解度的影響Fig.1　Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由圖1可知，0.5 h內(nèi)水解度增加較快，1～3 h時(shí)水解度增加緩慢，3～6 h后水解度呈平緩增加。這主要是因?yàn)槊附庵饕菙嚅_肽鍵，最初肽鍵數(shù)目多，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肽鍵數(shù)減少，水解度的增加且趨于平緩。從節(jié)約時(shí)間和能源考慮，乳清最佳酶解時(shí)間3.0 h。

2.1.2酶解溫度對(duì)乳清酶解液水解度的影響

由圖2可知，水解度隨酶解溫度的升高先增大后減小，溫度在45～55 ℃時(shí)范圍內(nèi)，水解度快速增加，當(dāng)溫度增加到60 ℃時(shí)，水解度最大，為25.8%，超過60 ℃水解度反而下降。由于60 ℃會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，使酶解產(chǎn)物的顏色變深，所以最佳溫度為55～60 ℃。這與劉利軍等［19］的研究結(jié)果一致。

圖2　酶解溫度對(duì)干酪乳清酶解液水解度的影響Fig.2　Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.1.3酶解pH值對(duì)水解度的影響

圖3　酶解pH值對(duì)干酪乳清酶解液水解度的影響Fig.3　Effect of initial pH on the degree of hydrolysis

由圖3可知，pH 8.5時(shí)，水解度較低；pH 9.0時(shí)，水解度最大，故選擇pH 9.0時(shí)為最適條件。

2.1.4酶與底物比（［E］/［S］）對(duì)水解度的影響

圖4?。?4 E］/［/S］對(duì)干酪乳清酶解液水解度的影響Fig.4　Effect of ［E］/［/S］ ratio on the degree of hydrolysis

由圖4可知，［E］/［S］在0.05%～5%時(shí)，水解度隨著［E］/［S］的增加而增加，［E］/［S］高于4%后，水解度的增加趨于平緩。從經(jīng)濟(jì)因素考慮，選擇［E］/［S］為4%～5%為最適值。這與劉利軍等［19］的研究結(jié)果一致。

2.1.5正交試驗(yàn)對(duì)干酪乳清酶解條件優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得到乳清酶解條件，以酶解溫度、酶解pH值、［E］/［S］、酶解時(shí)間為考察因素，并以水解度作為指標(biāo)，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1　干酪乳清酶解條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table1　Results of orthogonal array design for the hydrolysis of cheese whey

由表1中極差分析可知，各因素對(duì)水解度的影響順序依次為A＞B＞C＞D；極差分析中得到的最佳酶解條件為A1B1C2D3。該條件下的干酪乳清水解度為25.42%。這與彭新顏等［20］的研究結(jié)果相符。

各因素對(duì)水解度影響的方差分析結(jié)果如表2所示，四因素的F值均小于F0.05，說明各因素對(duì)干酪乳清水解度影響均不顯著。

表2　正交試驗(yàn)方差分析表Table2　ANOVA of experimental results from orthogonal arrayTable2　ANOVA of experimental results from orthogonal array

2.2干酪乳清酶解產(chǎn)物超濾操作條件的確定

2.2.1壓力對(duì)超濾膜膜通量的影響

圖5　操作壓力對(duì)超濾膜膜通量的影響Fig.5　Effect of operating pressure on ultrafiltration membrane flux

由圖5可知，在超濾開始階段，隨著操作壓力的增加，膜兩側(cè)壓力差也增加，導(dǎo)致膜通量快速升高。操作壓力的繼續(xù)增加，膜通量增加幅度變小?？紤]到本實(shí)驗(yàn)用膜的性質(zhì)，壓力控制在0.25 MPa。

2.2.2料液溫度對(duì)超濾膜膜通量的影響

圖6　料液溫度對(duì)超濾膜膜通量的影響Fig.6　Effect of hydrolysate temperature on ultrafiltration membrane flux

由圖6可知，當(dāng)料液溫度升高，膜通量也隨之增加。溫度升高時(shí)，部分熱敏性蛋白和風(fēng)味蛋白變性；還會(huì)使濾膜老化，消耗能量，滋生微生物。所以從超濾速率、膜材料的特性等方面考慮，最佳料液溫度為30 ℃。

2.2.3操作時(shí)間對(duì)超濾膜膜通量的影響

圖7　操作時(shí)間對(duì)超濾膜膜通量的影響Fig.7　Effect of ultrafiltration time on membrane flux

由圖7可知，膜通量隨著超濾時(shí)間的延長(zhǎng)而平緩下降趨勢(shì)，并呈穩(wěn)定趨勢(shì)；120 min以后，超濾膜表面上聚集大量大分子蛋白質(zhì)和水解液的組分，阻礙了小分子肽的通過，膜的截留率增加，膜通量降低。為了高效超濾及清洗工作的順利進(jìn)行，超濾膜應(yīng)該以120 min為一個(gè)運(yùn)行周期。

2.2.4料液pH值對(duì)超濾膜膜通量的影響

圖8　料液pH值對(duì)超濾膜膜通量的影響Fig.8　Effect of hydrolysate pH on ultrafiltration membrane flux

由圖8可知，膜通量隨著料液pH值的增加變化很小，即膜通量受料液的pH值影響不大；考慮到最終產(chǎn)品風(fēng)味，選用料液的初始pH 9.0。

2.3不同分子質(zhì)量范圍多肽的脂質(zhì)過氧化抑制率

圖9　不同分子質(zhì)量多肽的脂質(zhì)過氧化抑制率Fig.9　Inhibitory rates of peptides with various molecular weights on lipid peroxidation

由圖9可知，分子質(zhì)量大于6 000 D的酶解液的脂質(zhì)過氧化抑制率最低，為12.35%。而分子質(zhì)量在4 000～6 000 D范圍的酶解液脂質(zhì)過氧化抑制率最高，達(dá)到47.28%，高于未經(jīng)過超濾的酶解液脂質(zhì)過氧化抑制率。乳清酶解液的抑制脂質(zhì)過氧化的能力與多肽類型、不同游離氨基酸的比例有關(guān)。通過堿性蛋白酶酶解產(chǎn)生分子質(zhì)量范圍不同，氨基酸序列的不同兩性的、結(jié)構(gòu)可變的短肽，容易分散在油-水界面中，借助磷脂膜的作用而松散分布脂肪氧化體系中［20］。

2.4乳清水解產(chǎn)物G-50凝膠分離

圖10　Sephadex G-50凝膠層析純化干酪乳清酶解液Fig.10　Elution profile of hydrolysates by Sephadex G-50

由圖10可知，分子質(zhì)量在4 000～6 000 D范圍的乳清蛋白肽酶解液通過Sephadex G-50后，有2 個(gè)峰，紫外檢測(cè)峰對(duì)應(yīng)的管號(hào)分別為第17、34管，說明復(fù)合產(chǎn)物中主要含有2 種物質(zhì)。

取紫外檢測(cè)峰的第17、34管洗脫液分別進(jìn)行抗脂質(zhì)過氧化抑制率的測(cè)定（圖11）和Tricine-SDS-PAGE分析（圖12）。由圖11可知，第34管洗脫液的抗脂質(zhì)過氧化抑制率高達(dá)40.05%，高于第17管洗脫液的抗脂質(zhì)過氧化抑制率。由圖12可知，乳清酶解過程使得α-乳白蛋白、β-乳球蛋白分解，小分子肽增加。葡聚糖凝膠具有分子篩作用，酶解液的蛋白肽將按分子質(zhì)量大小，逐步洗脫而分離［15］，第17管（泳道1）的分子質(zhì)量大于第34管（泳道2）酶解液的分子質(zhì)量。因此，第34管酶解液抗氧化性較高，分子質(zhì)量在4 000～4 100 D之間。干酪乳清Alcalase 2.4L酶解液中抗氧化活性肽最終選擇第32、33、34、35、36管洗脫液作為乳清抗氧化肽收集對(duì)象。

圖11　Sephadex G-50凝膠層析純化第17和34管洗脫液的脂質(zhì)過氧化抑制率Fig.11　Inhibitory rates of fractions 17 and 34 from Sephadex G-50 column chromatography on lipid peroxidation

圖12　Sephadex G-50凝膠層析純化產(chǎn)物tricine-SDS-PAGE圖Fig.12　Tricine-SDS-PAGE gel electrophoresis of separated hydrolysates by Sephadex G-50 column chromatography

3　結(jié) 論

利用超濾從干酪乳清Alcalase 2.4L酶解液中提取抗氧化性蛋白肽。通過三因素三水平正交試驗(yàn)得到干酪乳清Alcalase 2.4L酶解的最優(yōu)條件，即酶解時(shí)間為2 h、pH 9.5、［E］/［S］為4%、酶解溫度為50 ℃。該條件下的干酪乳清水解度為25.42%。

乳清酶解物超濾的最佳條件為：壓力0.25 MPa，溫度為30 ℃，時(shí)間120 min，初始pH 9.0。分子質(zhì)量范圍在4 000～6 000 D范圍內(nèi)的肽酶解液脂質(zhì)過氧化抑制率最高，達(dá)到47.28%。將分子質(zhì)量4 000～6 000 D肽的酶解液，采用Sephadex G-50型葡聚糖凝膠進(jìn)行純化，將分離的組分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析和脂質(zhì)過氧化抑制率的測(cè)定，第34管洗脫液的抗氧化性最高，分子質(zhì)量范圍為4 000～4 100 D。將其樣品冷凍干燥制的固體粉末為抗氧化肽樣品。

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Isolation and Purification of Antioxidant Peptide from Cheese Whey Hydrolysates Produced with Alkaline Protease

HUO Jianxin1， YUAN Huiyan1， WANG Yan1， WANG Yan1， BAI Caiyan1， ZHAO Wenbo2，*
（1. Jinzhong University， Jinzhong 030600， China； 2. School of Food Engineering and Biological Technology，Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

Cheese whey hydrolysates were obtained by enzymatic hydrolysis with an alkaline protease “alcalase” for 2 h at 50 ℃ and an initial pH of 9.5 with an ［E］/［S］ ratio of 4%. The antioxidant peptide was purified from cheese whey hydrolysates by ultrafiltration， polydextran gel chromatography and tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis （tricine SDS-PAGE）. The optimal operating pressure， hydrolysate temperature and pH and ultrafiltration time for the improved ultrafiltration membrane flux were found to be 0.25 MPa， 30 ℃， 9.0 and 120 min， respectively. The peptide with molecular weights ranging from 4 000 to 6 000 D had the highest inhibitory activity on lipid peroxidation， with an inhibitory rate of approximately 47.28%. After purification with Sephadex G-50， the separated fractions were determined by tricine SDS-PAGE and lipid peroxidation inhibition， respectively. Fraction 34 with molecular weight distribution ranging from 4 000 to 4 100 D had the highest inhibitory activity on lipid peroxidation.

cheese whey； ultrafiltration； Alaclase 2.4L； antioxidant peptide

TS252.9

A

1002-6630（2015）13-0172-06

10.7506/spkx1002-6630-201513032

2014-09-20

山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2010127）

霍建新（1972—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：hjx1126@126.com

趙文博（1984—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：zhaowenbo1984140@163.com