來(lái)小丹，歐陽(yáng)凈，石英

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶400038）

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡中的作用

來(lái)小丹，歐陽(yáng)凈，石英

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶400038）

目的探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡中的作用。方法采用0，1.0，2.0，4.0 g/L苦參堿處理HOX-Rb44細(xì)胞24 h，MTT、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖活性及凋亡情況，Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP94，GRP78，ATF4以及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達(dá)水平。結(jié)果隨著苦參堿質(zhì)量濃度的增加，HOX-Rb44細(xì)胞增殖抑制增加，凋亡率顯著升高（P＜0.05），GRP78與GRP94的表達(dá)水平逐漸升高，ATF及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達(dá)升高。結(jié)論苦參堿處理視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、PERK-ATF4-CHOP通路可能在其中有重要作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；苦參堿；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；細(xì)胞凋亡

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（Rb）是小兒科常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率居眼內(nèi)惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅患兒的視力及生命［1］。在尚未擴(kuò)展期對(duì)該病患兒給予及時(shí)治療，存活率可達(dá)95%［2］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的獨(dú)立于死亡受體和線粒體途徑的第3條凋亡通路，近年研究表明，其參與帕金森病及阿爾茨海默病等疾病的發(fā)病，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡有重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激時(shí)蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）與Bip解離，PERK自身磷酸化被激活，磷酸化eIF2，抑制蛋白反應(yīng)過(guò)程，包括下游激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），ATF4作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)［3］。ATF4持續(xù)過(guò)表達(dá)將促進(jìn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因的表達(dá)上調(diào)，如轉(zhuǎn)錄因子CHOP等［4］，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［5］?？鄥A是苦參生物堿的主要活性成分。近年臨床及藥理學(xué)研究表明，苦參堿具有抗纖維化、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用，此外，張璐燁［6］的研究顯示，苦參堿能促進(jìn)HOX-Rb細(xì)胞凋亡，減少Rb細(xì)胞mRNA表達(dá)，降低細(xì)胞端粒酶活性，抑制細(xì)胞增殖。本研究中對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-ATF4-CHOP通路在苦參堿誘導(dǎo)Rb細(xì)胞凋亡中的作用，為尋找藥物干預(yù)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點(diǎn)，為Rb臨床藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥

流式細(xì)胞儀FACSAriaTM及分析軟件（美國(guó)BD公司）；熒光顯微鏡（美國(guó)Leica公司）；多功能離心機(jī)（瑞士Tecna公司）；垂直電泳槽（美國(guó)Bio-rad公司）；CO2培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本）。磷酸鹽緩沖液（PBS），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibcol），胎牛血清（Hyclone）；注射用青霉素鈉，注射用硫酸鏈霉素，四氮唑鹽（MTT），軟瓊脂，吖啶橙（AO），溴化乙啶（EB）均購(gòu)自sigma公司；苦參堿注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H10950071，規(guī)格為每支5 mL∶50 mg）。Model 550酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-rad公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；Hoechst 33342（北京雷根生物技術(shù)有限公司），人Rb細(xì)胞株（HXO-Rb44）來(lái)源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，一抗PERK，ATF4，CHOP及peIF2α等抗體購(gòu)自Cell Signal公司。

1.2 方法

HXO-Rb44細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞接種在含有RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)。培養(yǎng)1～2 d進(jìn)行傳代，以離心半徑8 cm，1 200 r/min 4℃離心15min，棄上清液，加入配置好的含有10%胎牛血清、50 U/mL鏈霉素、青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入不同質(zhì)量濃度苦參堿處理，對(duì)照組給予等量RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

MTT法觀察細(xì)胞增殖情況：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HXO-Rb44細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為20×104/mL，每孔種100μL細(xì)胞懸液加入不同質(zhì)量濃度苦參堿溶液（1.0，2.0，4.0 g/L），并設(shè)置空白對(duì)照組，每孔加MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)，加二甲基亞砜（DMSO）200μL，避光振蕩15min混勻后，比色。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-試驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490）×100%。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：收集細(xì)胞，加固定液，4℃固定10～20min，棄固定液，PBS洗2遍，棄上清液，保留約50μL，混勻后滴加在載玻片上，使細(xì)胞均勻分布，稍晾干后加500μLHoechst33342染液，染色5 min，吸水紙邊緣吸干后，PBS洗2遍，滴加抗熒光淬滅，熒光顯微鏡觀察。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將懸浮細(xì)胞直接收集到10mL離心管中，每個(gè)樣本有（1～5）×106個(gè)/mL細(xì)胞，1 000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，離心5min。用100μL的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15 min。離心5 min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不時(shí)振動(dòng)。流式細(xì)胞儀分析，激發(fā)光波長(zhǎng)用488 nm，用一波長(zhǎng)為515 nm的通帶濾器檢測(cè)異硫氰酸熒光素（FITC）熒光，另一波長(zhǎng)于560 nm的濾器檢測(cè)碘化丙啶（PI）。

Western Blot檢測(cè)：收集細(xì)胞，加200μL裂解液（50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/L PMSF，0.1%NP-40，蛋白酶抑制劑）。4℃，以離心半徑8 cm，12 000 r/min離心15min，取上清液，采用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50μg與等體積樣本緩沖液混合，沸水中加熱10min，冷卻后上樣到15% SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維（NC）膜，轉(zhuǎn)膜后考馬斯亮藍(lán)染色凝膠，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經(jīng)0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)HXO-Rb44增殖的影響，結(jié)果顯示其抑制率隨劑量增加而上升，呈明顯的劑量依賴性，處理質(zhì)量濃度增加，吸光度降低，HXO-Rb44增殖抑制率顯著增加（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)HXO-Rb44增殖的影響（±s）

表1 不同質(zhì)量濃度苦參堿對(duì)HXO-Rb44增殖的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

抑制率（%）0 g/L 6±0.045 3.72±0.021 1.0 g/L 1.426±0.038*17.21±1.161*2.0 g/L 1.018±0.044*36.52±2.461*4.0 g/L 0.864±0.037*49.52±3.047*

2.2 苦參堿處理后細(xì)胞凋亡情況

采用Hoechst33342/PI分析苦參堿處理后，隨著處理質(zhì)量濃度的提高，HXO-Rb44細(xì)胞出現(xiàn)凋亡細(xì)胞核濃縮，呈現(xiàn)出亮藍(lán)色，在2.0 g/L和4.0 g/L苦參堿處理后死亡細(xì)胞被PI染色，見(jiàn)圖1。流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示1.0，2.0，4.0 g/L苦參堿處理組對(duì)應(yīng)的凋亡率分別為13.8%，21.9%及53.1%，顯著高于對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

圖1 Hoechst33342/PI染色后熒光顯微鏡（×200）細(xì)胞凋亡情況

圖2 FCM檢測(cè)苦參堿處理后HXO-RB44細(xì)胞凋亡情況

2.3 PERK-ATF4-CHOP通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平分析

Western blot法檢測(cè)了HOX-Rb44細(xì)胞GRP94及GRP78及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，顯示隨著苦參堿質(zhì)量濃度的提高，HOX-Rb44細(xì)胞GRP78與GRP94的表達(dá)水平逐漸升高，提示高質(zhì)量濃度苦參堿會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。進(jìn)一步分析了ATF4及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達(dá)水平，顯示隨著苦參堿質(zhì)量濃度的提高，ATF4及PERK下游peIF2α及CHOP蛋白表達(dá)水平升高，見(jiàn)圖3和表2。

3 討論

圖3 HOX-Rb44細(xì)胞GRP94，GRP78及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

表2 苦參堿作用后HOX-Rb44細(xì)胞相關(guān)蛋白定量分析結(jié)果（±s）

表2 苦參堿作用后HOX-Rb44細(xì)胞相關(guān)蛋白定量分析結(jié)果（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

?

腫瘤的發(fā)生不僅由于細(xì)胞高增殖率，也與細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)，原癌基因的激活以及抑癌基因的失活，擾亂細(xì)胞的正常增殖、分化及凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)度，分化不足，最終發(fā)展為腫瘤［7］。腫瘤治療往往是選擇快速分裂的細(xì)胞為靶細(xì)胞，但臨床學(xué)這種解釋差強(qiáng)人意［8］，可治療的癌癥有時(shí)生長(zhǎng)緩慢，而抗藥性的癌癥也可能快速分裂，多項(xiàng)研究表明，治療可能是在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞凋亡試驗(yàn)也是一種篩選抗癌藥物的快捷、有效的方法［9-10］?？鄥A是由中藥苦參中分離出的一類活性物質(zhì)，是苦參生物堿的主要活性成分［11］，具有抗纖維化、抗病毒、抗炎、抗腫瘤等作用，能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［12］。苦參堿還能通過(guò)干擾細(xì)胞周期、降低端粒酶活性［13］、調(diào)控凋亡基因等多種機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞分化和增殖，誘導(dǎo)凋亡［14-15］。

PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，與GRP78解離后形成同源二聚體，并發(fā)生自身磷酸化被激活，PERK磷酸化被激活后使eIF2α磷酸化，并抑制其翻譯其實(shí)因子的功能，抑制大多數(shù)mRNA的翻譯，從而減少蛋白質(zhì)的合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊和穩(wěn)態(tài)［16］。eIF2α磷酸化能夠抑制大多數(shù)mRNA的翻譯，但ATF4mRNA翻譯增強(qiáng)，使ATF4合成增加，ATF4合成后轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，同樣有助于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。如無(wú)法恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明，在缺乏PERK及ATF4的癌細(xì)胞中，在缺氧條件下細(xì)胞凋亡水平顯著增加，PERK-eIF2-AFT4通路在體內(nèi)或體外環(huán)境下腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧應(yīng)激的重要因素。董傳芳等［17］的研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在AGE-BSA誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白GRP78，peIF2α及Caspase-12表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性。

本研究中分別用不同質(zhì)量濃度苦參堿處理細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示，隨著苦參堿質(zhì)量濃度的增加HOX-Rb44細(xì)胞凋亡率顯著升高；進(jìn)一步分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在苦參堿在誘導(dǎo)HOX-Rb44細(xì)胞凋亡中的作用，采用Western blot檢測(cè)了HOX-Rb44細(xì)胞GRP94及GRP78的表達(dá)水平，顯示GRP78與GRP94在處理組顯著較對(duì)照組升高；本研究中還分析了PERK信號(hào)通路peIF2α，ATF4及CHOP蛋白表達(dá)水平，顯示苦參堿處理24 h后HOX-Rb44細(xì)胞peIF2α及CHOP蛋白表達(dá)水平顯著升高。蛋白聚集激活eIF2a激酶-PERK并引起未折疊蛋白反應(yīng)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，eIF2a的磷酸化亦會(huì)導(dǎo)致翻譯的普遍抑制，其中包括ATF4。而CHOP被PERK下游轉(zhuǎn)錄因子ATF4等誘導(dǎo)，啟動(dòng)GADD34，Bim等基因，觸發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，采用苦參堿處理Rb細(xì)胞能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，PERK-ATF4-CHOP信號(hào)通路可能在其中有重要作用。

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Role of Endoplasmic Reticulum Stress PERK-ATF4-CHOP Pathway in Matrine Induced Retinoblastoma Apoptosis

Lai Xiaodan，Ouyang Jing，Shi Ying
（Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of The Third Military Medical University，Chongqing，China 400038）

Objective To analyze the role of endoplasmic reticulum stress PERK-ATF4-CHOP pathway in matrine induced retinoblastoma cells apoptosis.Methods Different concentrations of 0,1.0,2.0,4.0 g/L matrine was used to treat the HOX-Rb44cells for 24 h，the cell viability was determined by MTT assay,HOX-RB44 apoptosis situation was determined by ow cytometry，western blot analysis was used to dectect the Bax，Bcl-2，GRP78，GRP94，AFT4，peIF2αand CHOP expression.Results As the increase of concentration of matrine，HOX-Rb44apoptosis rate increased significantly（P＜0.05）,GRP78 and GRP94 increased significantly,and ATF and PERK downstream peIF2αand CHOP were also increased significantly.Conclusion Matrine could promoted HOX-Rb44cell apoptosis,endoplasmic reticulum stress,where PERK-ATF4-CHOP pathway may play an important role.

endoplasmic reticulum stress；matrine；retinoblastoma；cell apoptosis

R285.5；R286

A

1006-4931（2015）22-0056-03

來(lái)小丹，女，碩士研究生，主管藥師，主要從事藥品采購(gòu)工作，（電話）023-68754953（電子信箱）xiaodan-lai@ sina.com。

2015-05-13；

2015-08-04）