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        傷科健骨湯對(duì)大鼠四肢開(kāi)放性骨折模型中VEGF表達(dá)及局部組織學(xué)表現(xiàn)的影響

        2015-10-19 03:11:27林小永陳亮
        新中醫(yī) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:傷科開(kāi)放性免疫組化

        林小永,陳亮

        中山市中醫(yī)院骨二科,廣東 中山528400

        傷科健骨湯對(duì)大鼠四肢開(kāi)放性骨折模型中VEGF表達(dá)及局部組織學(xué)表現(xiàn)的影響

        林小永1,陳亮2

        中山市中醫(yī)院骨二科,廣東 中山528400

        目的:觀察在大鼠四肢開(kāi)放性骨折模型早期愈合過(guò)程中,傷科健骨湯對(duì)血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)及骨折端局部組織學(xué)改變的影響。方法:將SPF級(jí)SD大鼠造成開(kāi)放性股骨骨折模型,術(shù)后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各18只。實(shí)驗(yàn)組造模后第2天即開(kāi)始以傷科健骨湯濃縮液灌服,對(duì)照組僅給予正常飼養(yǎng)。術(shù)后第1周、2周、4周,分批處死動(dòng)物取材行免疫組化染色及圖像分析測(cè)定,酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)測(cè)定血清VEGF表達(dá)的強(qiáng)度。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2周、4周的VEGF濃度與對(duì)照組相比,差異均有顯著性意義(P<0.05)。局部組織免疫組化染色及圖像分析測(cè)定顯示,實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)在1、2、4周時(shí)均強(qiáng)于對(duì)照組,其中在第2周時(shí)染色陽(yáng)性強(qiáng)度最高,第4周陽(yáng)性強(qiáng)度降低,但仍強(qiáng)于對(duì)照組。結(jié)論:傷科健骨湯在大鼠四肢骨折愈合早期可正向調(diào)高VEGF水平,從而促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖,加快骨折端骨性連接形成,起到促進(jìn)骨折愈合的作用。

        開(kāi)放性骨折;傷科健骨湯;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF);大鼠;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

        血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在骨創(chuàng)傷的正常血管生成、骨痂結(jié)構(gòu)和礦化以及軟骨改建中發(fā)揮著極其重要的作用,但目前該類研究多停留在分子生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi),中醫(yī)藥治療骨創(chuàng)傷有著悠久的歷史和突出的臨床效果,但對(duì)其具體作用機(jī)理的研究尚不深入,本研究將二者通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行結(jié)合,建立大鼠四肢開(kāi)放性骨折模型進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn),觀察在四肢開(kāi)放性骨折早期愈合過(guò)程中,傷科健骨湯對(duì)體內(nèi)血清中VEGF表達(dá)及骨折端局部組織學(xué)表現(xiàn)的影響,探討其治療四肢開(kāi)放性骨折的作用機(jī)制,以進(jìn)一步明確其促進(jìn)骨折愈合的機(jī)理。

        1 材料

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)SD大鼠,58只,雌雄各29只,體質(zhì)量180~200 g,4~6周齡。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,遵循中國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.2 主要試劑及儀器 傷科健骨湯是本院骨科經(jīng)驗(yàn)方,組成:懷牛膝、續(xù)斷、透骨草、獨(dú)活各15 g,補(bǔ)骨脂、三七、川芎、當(dāng)歸、雞血藤各10 g,甘草5 g,水浸泡30m in,煎3次,每次煎開(kāi)10m in后過(guò)濾取汁,將3次汁液混合,并統(tǒng)一濃縮為質(zhì)量濃度2 g/m L的藥液,由本院中藥房煎制;抗鼠VEGF的酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司提供);即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司,Sw-CJ);GENIOS多功能酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 造模與分組58只SD大鼠飼養(yǎng)于本院藥學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫20℃,相對(duì)濕度60%,自由攝食、飲水,每周監(jiān)測(cè)體質(zhì)量。用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字生成法將大鼠隨機(jī)分為造模組40只和正常對(duì)照組18只。2組均給予全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料(含12%脂肪、60%碳水化合物、28%蛋白質(zhì))。

        2.1.1 開(kāi)放性骨折模型的建立 采用腹腔注射麻醉的方法,于大鼠右下腹部注射3%戊巴比妥鈉,按每1 kg體重1m g的劑量,計(jì)算藥物濃度,左后肢股骨部術(shù)區(qū)常規(guī)備皮、消毒,取前外側(cè)切口,沿肌間隙盡量鈍性分離骨面,顯露股骨干,于股骨干中1/3處呈短斜形截?cái)?,?.2~1.5mm的克氏針做髓內(nèi)固定以固定折端,檢查對(duì)位對(duì)線良好,固定穩(wěn)固后,沖洗縫合傷口,安爾碘每天消毒傷口預(yù)防感染。

        2.1.2 分組方法 在造模成功的大鼠中選取健康狀況良好的36只,用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)字生成法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各18只。

        2.2 給藥方法 實(shí)驗(yàn)組造模后第2天即開(kāi)始以傷科健骨湯濃縮液灌服,按10倍成人劑量換算為15m L/(kg·d),分2次給藥。對(duì)照組僅給予正常飼養(yǎng)。

        2.3 血清中VEGF的測(cè)定 術(shù)后第1周、2周、4周應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字生成法,每組分別抽取6只大鼠拍X線片后處死,取骨折端局部組織標(biāo)本固定保存后待測(cè)。心臟取血,離心15m in分離血清,-70℃低溫保存待測(cè)。VEGF含量的測(cè)定采用ELISA。

        2.4 VEGF免疫組織化學(xué)檢測(cè) 術(shù)后第1周、2周、4周,取大鼠的局部組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、硝酸脫鈣,石蠟切片。采用即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。免疫組化染色片電子顯微鏡下計(jì)算免疫組化染色的平均光密度值和積分光密度值進(jìn)行半定量分析。

        2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得的數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

        3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        3.1 2組各時(shí)間點(diǎn)血清VEGF濃度比較 見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2周、4周的VEGF濃度與前1周比較,差異均有顯著性意義(P<0.05),2組間第2周、4周的VEGF濃度分別比較,差異均有顯著性意義(P<0.05)。

        表1 2組各時(shí)間點(diǎn)血清VEGF濃度比較±s)mg/L

        表1 2組各時(shí)間點(diǎn)血清VEGF濃度比較±s)mg/L

        與本組第1周比較,①P<0.05;與本組第2周比較,②P<0.05;與對(duì)照組同期比較,③P<0.05

        組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組n 18 18第1周158.30±11.06 147.65±4.55第2周178.50±9.97①③151.28±8.30第4周170.45±12.55②③160.37±3.15

        3.2 局部組織學(xué)觀察結(jié)果 見(jiàn)圖1、2、3。實(shí)驗(yàn)組VEGF的表達(dá)在1、2、4周時(shí)均強(qiáng)于對(duì)照組,其中在第2周時(shí)染色陽(yáng)性強(qiáng)度最高,第4周陽(yáng)性強(qiáng)度降低但仍優(yōu)于對(duì)照組。其中術(shù)后第1周,2組均出現(xiàn)較強(qiáng)陽(yáng)性染色,實(shí)驗(yàn)組程度稍強(qiáng)于對(duì)照組,但優(yōu)勢(shì)不明顯;術(shù)后第2周,實(shí)驗(yàn)組局部組織染色陽(yáng)性強(qiáng)度高于對(duì)照組,二者差異明顯,且實(shí)驗(yàn)組局部軟骨痂、成骨細(xì)胞、新生血管內(nèi)皮細(xì)胞密度明顯高于對(duì)照組,端斷組織增生活躍。術(shù)后第4周,2組VEGF仍呈持續(xù)陽(yáng)性表達(dá),但差異程度稍有下降。

        圖1 術(shù)后第1周

        圖2 術(shù)后第2周

        圖3 術(shù)后第4周

        4 討論

        隨著人們對(duì)骨折愈合機(jī)制研究的深入,逐漸認(rèn)識(shí)到人類骨骼在骨折發(fā)生后的愈合過(guò)程中,受到諸多因素的影響,這之中骨折斷端的血供是最基本的因素,也是最重要的因素,而創(chuàng)傷后血管的生成可通過(guò)很多誘導(dǎo)因子誘導(dǎo),有研究顯示,唯有VEGF對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有特異性,能促使其增殖及血管的生成,同時(shí)又能增加血管的通透性[1~2]。類似的研究也證實(shí),VEGF在骨骼生成及其代謝過(guò)程中均起到極為關(guān)鍵的作用,如初同偉等[3]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用VEGF組骨折端局部血流量明顯高于對(duì)照組,而使用VEGF抗體組則出現(xiàn)骨不連及不愈合。文獻(xiàn)[4]報(bào)道顯示,在骨折的愈合過(guò)程中,VEGF能通過(guò)促進(jìn)骨折端及其周圍軟組織血管的生成,特異性增加局部的血流量,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)軟骨的生成與成熟,增進(jìn)成骨細(xì)胞與軟骨內(nèi)骨化之間的相互作用,誘導(dǎo)成骨,進(jìn)而加快骨折愈合過(guò)程。國(guó)外有研究也發(fā)現(xiàn),在骨折部位應(yīng)用VEGF腺病毒轉(zhuǎn)染的方法可促進(jìn)骨折愈合[5]。

        傷科健骨湯為本院骨科應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方,臨床效果明顯,但其具體作用機(jī)理尚不明確,極大地制約了對(duì)外學(xué)術(shù)交流及進(jìn)一步現(xiàn)代化開(kāi)發(fā),本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:傷科健骨湯在大鼠四肢骨折愈合早期可正向調(diào)高VEGF水平,從而促進(jìn)骨折斷端微血管新生增殖,加快骨折端骨性連接形成,起到促進(jìn)骨折愈合的作用。尤其是術(shù)后第2周,實(shí)驗(yàn)組骨折斷端局部組織中VEGF表達(dá)明顯高于對(duì)照組,提示傷科健骨湯能促進(jìn)VEGF的合成分泌,從而有效地促進(jìn)了骨修復(fù)過(guò)程中血管的形成和骨生成,這可能是其促進(jìn)骨折愈合的重要機(jī)制。但必須指出的是,骨折愈合是多種因素共同參與、相互協(xié)同的復(fù)雜過(guò)程,VEGF只是其中的一個(gè)方面,關(guān)于傷科健骨湯是如何干預(yù)其他骨生長(zhǎng)因子的,還需進(jìn)一步研究。

        [1]Ferrara N,Henzel WJ.Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding grow th factor[J].Biochem Biophys Res Comm un,1989,161(2):851-858.

        [2]Keck PJ,Hauser SD,KriviG,et al.Vascular permeability factor,an endothelial cell mitogen regulated to PDGF[J].Science,1989,246(4935):1309-1312.

        [3]初同偉,王正國(guó),朱佩芳,等.血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在骨折愈合過(guò)程中的作用[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2002,16(2):75-78.

        [4]鐘剛,裴福興,樊瑜波.血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)矯形外科雜志,2004, 12(8):604-606.

        [5]Lattermann C,Baltzer AW,Zelle BA,et al.Feasibility of percutaneous gene transfer to an atrophic nonunion in a rabbit[J].Clin Orthop Relat Res,2004(425):237-243.

        (責(zé)任編輯:劉淑婷,吳凌)

        R683

        A

        0256-7415(2015)02-0218-02

        10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.102

        2014-10-09

        廣東省中山市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20132A176)

        林小永(1978-),男,副主任醫(yī)師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)傷骨科的臨床及研究工作。

        陳亮,E-mail:chenliang211@163.com。

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