林小永，陳亮

中山市中醫(yī)院骨二科，廣東 中山528400

傷科健骨湯對大鼠四肢開放性骨折模型中VEGF表達及局部組織學表現(xiàn)的影響

林小永1，陳亮2

中山市中醫(yī)院骨二科，廣東 中山528400

目的：觀察在大鼠四肢開放性骨折模型早期愈合過程中，傷科健骨湯對血清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達及骨折端局部組織學改變的影響。方法：將SPF級SD大鼠造成開放性股骨骨折模型，術后將造模成功的大鼠隨機分為實驗組和對照組各18只。實驗組造模后第2天即開始以傷科健骨湯濃縮液灌服，對照組僅給予正常飼養(yǎng)。術后第1周、2周、4周，分批處死動物取材行免疫組化染色及圖像分析測定，酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）測定血清VEGF表達的強度。結(jié)果：實驗組術后第2周、4周的VEGF濃度與對照組相比，差異均有顯著性意義（P＜0.05）。局部組織免疫組化染色及圖像分析測定顯示，實驗組VEGF的表達在1、2、4周時均強于對照組，其中在第2周時染色陽性強度最高，第4周陽性強度降低，但仍強于對照組。結(jié)論：傷科健骨湯在大鼠四肢骨折愈合早期可正向調(diào)高VEGF水平，從而促進骨折斷端微血管新生增殖，加快骨折端骨性連接形成，起到促進骨折愈合的作用。

開放性骨折；傷科健骨湯；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）；大鼠；動物實驗

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在骨創(chuàng)傷的正常血管生成、骨痂結(jié)構(gòu)和礦化以及軟骨改建中發(fā)揮著極其重要的作用，但目前該類研究多停留在分子生物學領域內(nèi)，中醫(yī)藥治療骨創(chuàng)傷有著悠久的歷史和突出的臨床效果，但對其具體作用機理的研究尚不深入，本研究將二者通過實驗設計進行結(jié)合，建立大鼠四肢開放性骨折模型進行對照試驗，觀察在四肢開放性骨折早期愈合過程中，傷科健骨湯對體內(nèi)血清中VEGF表達及骨折端局部組織學表現(xiàn)的影響，探討其治療四肢開放性骨折的作用機制，以進一步明確其促進骨折愈合的機理。

1 材料

1.1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠，58只，雌雄各29只，體質(zhì)量180～200 g，4～6周齡。由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，遵循中國科學技術委員會頒發(fā)的《實驗動物管理條例》進行實驗。

1.2 主要試劑及儀器 傷科健骨湯是本院骨科經(jīng)驗方，組成：懷牛膝、續(xù)斷、透骨草、獨活各15 g，補骨脂、三七、川芎、當歸、雞血藤各10 g，甘草5 g，水浸泡30m in，煎3次，每次煎開10m in后過濾取汁，將3次汁液混合，并統(tǒng)一濃縮為質(zhì)量濃度2 g/m L的藥液，由本院中藥房煎制；抗鼠VEGF的酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司提供）；即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，Sw-CJ）；GENIOS多功能酶標儀（奧地利TECAN公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組58只SD大鼠飼養(yǎng)于本院藥學部實驗動物中心，室溫20℃，相對濕度60%，自由攝食、飲水，每周監(jiān)測體質(zhì)量。用計算機隨機數(shù)字生成法將大鼠隨機分為造模組40只和正常對照組18只。2組均給予全價營養(yǎng)顆粒飼料（含12%脂肪、60%碳水化合物、28%蛋白質(zhì)）。

2.1.1 開放性骨折模型的建立 采用腹腔注射麻醉的方法，于大鼠右下腹部注射3%戊巴比妥鈉，按每1 kg體重1m g的劑量，計算藥物濃度，左后肢股骨部術區(qū)常規(guī)備皮、消毒，取前外側(cè)切口，沿肌間隙盡量鈍性分離骨面，顯露股骨干，于股骨干中1/3處呈短斜形截斷，取1.2～1.5mm的克氏針做髓內(nèi)固定以固定折端，檢查對位對線良好，固定穩(wěn)固后，沖洗縫合傷口，安爾碘每天消毒傷口預防感染。

2.1.2 分組方法 在造模成功的大鼠中選取健康狀況良好的36只，用計算機隨機數(shù)字生成法隨機分為實驗組和對照組各18只。

2.2 給藥方法 實驗組造模后第2天即開始以傷科健骨湯濃縮液灌服，按10倍成人劑量換算為15m L/（kg·d），分2次給藥。對照組僅給予正常飼養(yǎng)。

2.3 血清中VEGF的測定 術后第1周、2周、4周應用隨機數(shù)字生成法，每組分別抽取6只大鼠拍X線片后處死，取骨折端局部組織標本固定保存后待測。心臟取血，離心15m in分離血清，-70℃低溫保存待測。VEGF含量的測定采用ELISA。

2.4 VEGF免疫組織化學檢測 術后第1周、2周、4周，取大鼠的局部組織標本經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、硝酸脫鈣，石蠟切片。采用即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。免疫組化染色片電子顯微鏡下計算免疫組化染色的平均光密度值和積分光密度值進行半定量分析。

2.5 統(tǒng)計學方法 所得的數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 2組各時間點血清VEGF濃度比較 見表1。實驗組術后第2周、4周的VEGF濃度與前1周比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05），2組間第2周、4周的VEGF濃度分別比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05）。

表1 2組各時間點血清VEGF濃度比較±s）mg/L

表1 2組各時間點血清VEGF濃度比較±s）mg/L

與本組第1周比較，①P＜0.05；與本組第2周比較，②P＜0.05；與對照組同期比較，③P＜0.05

組別實驗組對照組n 18 18第1周158.30±11.06 147.65±4.55第2周178.50±9.97①③151.28±8.30第4周170.45±12.55②③160.37±3.15

3.2 局部組織學觀察結(jié)果 見圖1、2、3。實驗組VEGF的表達在1、2、4周時均強于對照組，其中在第2周時染色陽性強度最高，第4周陽性強度降低但仍優(yōu)于對照組。其中術后第1周，2組均出現(xiàn)較強陽性染色，實驗組程度稍強于對照組，但優(yōu)勢不明顯；術后第2周，實驗組局部組織染色陽性強度高于對照組，二者差異明顯，且實驗組局部軟骨痂、成骨細胞、新生血管內(nèi)皮細胞密度明顯高于對照組，端斷組織增生活躍。術后第4周，2組VEGF仍呈持續(xù)陽性表達，但差異程度稍有下降。

圖1 術后第1周

圖2 術后第2周

圖3 術后第4周

4 討論

隨著人們對骨折愈合機制研究的深入，逐漸認識到人類骨骼在骨折發(fā)生后的愈合過程中，受到諸多因素的影響，這之中骨折斷端的血供是最基本的因素，也是最重要的因素，而創(chuàng)傷后血管的生成可通過很多誘導因子誘導，有研究顯示，唯有VEGF對內(nèi)皮細胞有特異性，能促使其增殖及血管的生成，同時又能增加血管的通透性［1～2］。類似的研究也證實，VEGF在骨骼生成及其代謝過程中均起到極為關鍵的作用，如初同偉等［3］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，使用VEGF組骨折端局部血流量明顯高于對照組，而使用VEGF抗體組則出現(xiàn)骨不連及不愈合。文獻［4］報道顯示，在骨折的愈合過程中，VEGF能通過促進骨折端及其周圍軟組織血管的生成，特異性增加局部的血流量，促進內(nèi)皮細胞增殖，調(diào)節(jié)軟骨的生成與成熟，增進成骨細胞與軟骨內(nèi)骨化之間的相互作用，誘導成骨，進而加快骨折愈合過程。國外有研究也發(fā)現(xiàn)，在骨折部位應用VEGF腺病毒轉(zhuǎn)染的方法可促進骨折愈合［5］。

傷科健骨湯為本院骨科應用多年的經(jīng)驗方，臨床效果明顯，但其具體作用機理尚不明確，極大地制約了對外學術交流及進一步現(xiàn)代化開發(fā)，本次實驗結(jié)果顯示：傷科健骨湯在大鼠四肢骨折愈合早期可正向調(diào)高VEGF水平，從而促進骨折斷端微血管新生增殖，加快骨折端骨性連接形成，起到促進骨折愈合的作用。尤其是術后第2周，實驗組骨折斷端局部組織中VEGF表達明顯高于對照組，提示傷科健骨湯能促進VEGF的合成分泌，從而有效地促進了骨修復過程中血管的形成和骨生成，這可能是其促進骨折愈合的重要機制。但必須指出的是，骨折愈合是多種因素共同參與、相互協(xié)同的復雜過程，VEGF只是其中的一個方面，關于傷科健骨湯是如何干預其他骨生長因子的，還需進一步研究。

［1］Ferrara N，Henzel WJ.Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding grow th factor［J］.Biochem Biophys Res Comm un，1989，161（2）：851-858.

［2］Keck PJ，Hauser SD，KriviG，et al.Vascular permeability factor，an endothelial cell mitogen regulated to PDGF［J］.Science，1989，246（4935）：1309-1312.

［3］初同偉，王正國，朱佩芳，等.血管內(nèi)皮細胞生長因子在骨折愈合過程中的作用［J］.中國修復重建外科雜志，2002，16（2）：75-78.

［4］鐘剛，裴福興，樊瑜波.血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染促進骨折愈合的實驗研究［J］.中國矯形外科雜志，2004， 12（8）：604-606.

［5］Lattermann C，Baltzer AW，Zelle BA，et al.Feasibility of percutaneous gene transfer to an atrophic nonunion in a rabbit［J］.Clin Orthop Relat Res，2004（425）：237-243.

（責任編輯：劉淑婷，吳凌）

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0256-7415（2015）02-0218-02

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.102

2014-10-09

廣東省中山市科技攻關計劃項目（20132A176）

林小永（1978-），男，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)傷骨科的臨床及研究工作。

陳亮，E-mail：chenliang211@163.com。