王彥麗 戚光祖等

[摘要] 目的 探討經(jīng)典的斷裂點(diǎn)簇集區(qū)/Abelson白血病病毒（BCR/ABL）融合基因陰性骨髓增殖性腫（MPN）患者中鈣網(wǎng)蛋白（CALR）基因突變的發(fā)生率，分析CALR基因突變陽(yáng)性MPN的臨床特點(diǎn)。 方法 依據(jù)2008年WHO造血組織和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)2012年1月～2015年3月在臨沂市沂水中心醫(yī)院就診的72例臨床初診為“MPN”患者進(jìn)行診斷時(shí)采用直接測(cè)序法檢測(cè)CALR基因突變，采用等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)（AS-PCR）檢測(cè)JAK2V617F突變。分析CALR基因突變陽(yáng)性MPN的臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)。 結(jié)果 在22例真性紅細(xì)胞增多癥（PV）患者中16例攜帶有JAK2V617F突變（突變率為68%），未檢測(cè)出CALR基因突變；26例原發(fā)性血小板增多癥（ET）患者中12例攜帶有JAK2V617F突變（突變率為46%），8例檢測(cè)出CALR基因突變（突變率為31%），JAK2V617F突變陰性患者中CALR基因突變率為57%（8/14）；23例原發(fā)性骨髓纖維化（PMF）患者中11例攜帶有JAK2V617F基因突變（突變率為49%），8例檢測(cè)出CALR基因突變（突變率為35%），JAK2V617突變陰性患者中CALR基因突變?yōu)闉?7%（8/12）。72例患者中均未檢測(cè)到MPL515突變。 結(jié)論 CALR基因突變是JAK2V617突變陰性的MPN特異性分子標(biāo)志物。將CALR基因突變檢測(cè)納入MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)可以提高診斷的準(zhǔn)確性減少漏診率。

[關(guān)鍵詞] 骨髓增殖性腫瘤； CALR基因；JAK2基因；突變

[中圖分類號(hào)] R551.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）09（b）-0086-04

BCR/ABL1融合基因陰性的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative meoplasm，MPN）是一組起源于多能造血干細(xì)胞的惡性腫瘤，表現(xiàn)為骨髓細(xì)胞一系或多系過度增殖，包括真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocthemia，ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF），臨床上有發(fā)生動(dòng)靜脈血栓、髓外造血、骨髓纖維化、甚至向白血病轉(zhuǎn)化[1-2]。JAK2V617F突變見于97%的PV，50%～60%的ET及PMF患者[3]。MPL515基因突變可見于3%～5%的JAK2V617F突變陰性的ET及PMF患者[4]。自2005年JAK2V617F和MPL515突變相繼被發(fā)現(xiàn)并納入WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，該突變的發(fā)現(xiàn)改變了MPN的診斷和分類，從分子的角度詮釋了MPN的發(fā)病機(jī)制。但仍有40%的ET及PMF患者未檢測(cè)到JAK2V617F基因突變，最近研究發(fā)現(xiàn)CALR見于JAK2V617F陰性的ET及PMF患者，本研究對(duì)臨床初診MPN患者進(jìn)行了JAK2V617F、CALR及MPL515基因突變分析，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月～2015年3月在臨沂市沂水中心醫(yī)院就診的72例初診MPN患者。其中PV23例，男11例，女12例，年齡38～72歲；ET26例，男12例，女14例，年齡25～80歲；PMF23例，男16例，女7例，年齡39～76歲。所有患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

1.2 檢驗(yàn)指標(biāo)

對(duì)患者臨床資料、骨髓和外周血涂片、骨髓活檢進(jìn)行分析，按照WHO造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)（2008）進(jìn)行診斷。

1.3 方法

CALR基因突變分析：用血液基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit，生產(chǎn)商：Qiagen公司）提取骨髓細(xì)胞基因組DNA，CALR9號(hào)外顯子PCR擴(kuò)增引物（生產(chǎn)商：Invitrogen公司；使用濃度：5.0 pmol/μL；貯存條件：干粉于-20℃保存，工作液于4℃保存；有效期：-20℃為1年，4℃為半年），設(shè)計(jì)序列：引物名稱：CALR-X9-Fwd，引物序列：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT；引物名稱：CALR-X9-Rev，引物序列：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。PCR體系包括DNA 50～100 ng，2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN公司產(chǎn)品）15 μL，正反向引物各0.5 μL，加去水離子補(bǔ)足體系至30 μL。反應(yīng)條件：98°C預(yù)變性3 min，98°C變性10 s，63°C退火30 s，72°C延伸30 s，共29個(gè)循環(huán)，72°C延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用片段分析軟件Genemapperid V4.1進(jìn)行分析，分析示例見圖1。

2 結(jié)果

2.1 72例MPN患者臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)

根據(jù)2008年WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn)，PV 22例、ET 26例、PMF 23例、MPN-u 1例。所有患者均接受常規(guī)治療至隨訪結(jié)束，患者均存活。在8例CALR突變的ET患者血小板計(jì)數(shù)高于JAK2突變陽(yáng)性患者（表1）；8例CALR突變的PMF患者中7例為男性，發(fā)病年齡較小，且呈現(xiàn)出較低的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平（表2）。

2.2 JAK2V617F、CALR及MPL515基因突變檢測(cè)結(jié)果

22例PV患者中16例攜帶有JAK2V617F突變（突變率為68%），未檢測(cè)出CALR基因突變；26例ET患者中12例攜帶有JAK2V617F突變（突變率為46%），8例檢測(cè)出CALR基因突變（突變率為31%），JAK2V617F突變陰性患者中CALR基因突變率為57%（8/14）；23例PMF患者中11例攜帶有JAK2V617F突變（突變率為49%），8例檢測(cè)出CALR基因突變（突變率為35%），JAK2V617突變陰性患者中CALR基因突變?yōu)闉?7%（8/12）。在72例患者中均未檢測(cè)到MPL515突變。

3 討論

CALR為Ca2+結(jié)合蛋白復(fù)合體，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（edoplasmic reticulum，ER）腔內(nèi)。CALR基因定位于染色體19p13.2～p13.3，包含9個(gè)外顯子，大小為4.2 kb，其編碼的CALR由高度保守近似球形結(jié)構(gòu)的N端（1～180氨基酸殘基）、參與ER內(nèi)Ca2+儲(chǔ)存的酸性c端（291～400氨基酸殘基）及中間富含脯氨酸而形成的具伸出式結(jié)構(gòu)的P端（181～290氨基酸殘基）。3個(gè)結(jié)構(gòu)域均具有各自特殊的功能，N端及P端主要發(fā)揮分子伴侶的作用，C端的作用主要為調(diào)節(jié)ER中的Ca2+濃度，保持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，CALR基因缺失將減少ER內(nèi)Ca2+的儲(chǔ)存量。CALR C端的終點(diǎn)為ER滯留信號(hào)（KDEI）肽，KDEL可使CALR從高爾基體回到ER，阻止其分泌至ER外，具有靶向定位作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CALR突變呈陽(yáng)性MPN患者骨髓細(xì)胞中突變型CALR大部分定位于ER內(nèi)[6]。同時(shí)，CALR介導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可影響多種細(xì)胞功能，包括巨核細(xì)胞分化成熟及血小板的形成、整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、增殖及吞噬作用、介導(dǎo)傷口愈合及纖維化。早期研究證實(shí)BCR/ABL1陰性MPN患者存在JAK2V617突變。Kampfl等[6]和Nangalia等[7]采用外顯子測(cè)序的方法在JAK2/MPL陰性的大部分標(biāo)本中檢測(cè)到CALR第9個(gè)外顯子突變。并對(duì)大樣本健康人群進(jìn)行CALR目標(biāo)基因檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康個(gè)體對(duì)照組、淋巴系腫瘤、急性白血病及實(shí)體腫瘤中均未見CALR基因突變。結(jié)果提示CALR基因突變?yōu)镴AK2及MPL基因突變陰性的ET及PMF的特異性分子標(biāo)志物。因CALR基因突變均位于第9個(gè)外顯子，本研究采用直接檢測(cè)第9個(gè)外顯子的方法在JAK2基因突變陰性的ET患者中檢測(cè)到CALR突變率為57%；23例PMF患者中8例檢測(cè)出CALR基因突變（突變率35%）；研究表明，CALR基因突變不會(huì)發(fā)生在PV患者中，本組22例患者中均未檢測(cè)到CALR基因突變也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。2014年，Tefferi等[8]檢測(cè)了576例ET患者中，CALR的突變率為15%；Rumi等[9]檢測(cè)了745例患者，CALR的突變率為24%；Chi等[10]檢測(cè)了289例患者，CALR的突變率為9%；Kim等[11]檢測(cè)CALR突變率為12.6%。本實(shí)驗(yàn)中ET患者CALR的突變率為31%，在JAK2/MPL陰性的ET患者中突變率57%，而國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道436例亞洲人CALR基因突變情況，CALR基因的突變率為22.7%，在JAK2/MPL陰性的ET患者中，其突變率為52.7%，本實(shí)驗(yàn)與國(guó)內(nèi)報(bào)道相符。Rumi等[12]對(duì)CALR 突變呈陽(yáng)性ET患者研究發(fā)現(xiàn)，極少數(shù)患者的CALR突變的等位基因負(fù)荷>75%，該結(jié)果推測(cè)ET的發(fā)生可能為雜合子克隆逐步積累，最終在骨髓中占據(jù)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，特異性刺激巨核細(xì)胞導(dǎo)致。本研究顯示CALR 突變患者均為雜合子。本研究中PMF患者CALR基因突變（突變率35%），與Langabeer等[13]報(bào)道的25%～35%的突變率相似。研究發(fā)現(xiàn)CALR突變與其臨床表現(xiàn)和預(yù)后有重要的相關(guān)性。在ET和PMF患者中，CALR基因突變PMF患者較JAK2突變者血小板計(jì)數(shù)更高、年齡更小、血紅蛋白更低，白細(xì)胞計(jì)數(shù)更低，PMF患者具有更好的生存率[14]，本研究中患者也具有以上臨床特點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)生CALR和JAK2突變者發(fā)生心血管事件的概率是13.4%和30.1%，10年血栓癥累計(jì)發(fā)生率分別為5.1%和14.5%。在PMF患者中，Tefferi等[8]在254例標(biāo)本中篩查了一些與MPN相關(guān)的基因突變，發(fā)現(xiàn)他們與CALR突變沒有顯著的分子或遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)。Tefferi等[15]也報(bào)道在PMF患者中，發(fā)生1型CALR突變者比2型突變者有更好的預(yù)后。由本組實(shí)驗(yàn)可以看出，CALR是MPN中較易發(fā)生突變的基因，可將CALR突變檢測(cè)納入MPN診斷的常規(guī)指標(biāo)。在臨床上可以遵循以下思路考慮對(duì)MPN的診斷[16-20]：①由于CALR突變不發(fā)生在PV的患者，所以它不能用來篩查PV或PV后骨髓纖維化的疑似患者；②CALR、JAK2和MPL突變是互相排斥的，對(duì)已知發(fā)生了JAK2 或MPL突變的患者無(wú)需篩查CALR突變；③由于MPL突變率在三者中最低，對(duì)ET或PMF的疑似病例，應(yīng)先行JAK2V617突變篩查，若陰性再行CALR突變篩查，CALR陰性則行MPL突變篩查。盡管CALR基因突變等為疾病的診斷提供了較為特異的分子指標(biāo)，但仍有10%的ET和PMF患者需要結(jié)合骨髓病理檢查結(jié)果加以診斷。

綜上所述，CALR基因突變是JAK2V617F突變陰性的MPN特異性分子標(biāo)志物。將CALR基因突變檢測(cè)納入MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)可以提高診斷的準(zhǔn)確性減少漏診率。CALR基因突變的檢測(cè)有助于JAK2V617F突變陰性的MPN的鑒別診斷，對(duì)CALR基因突變功能的進(jìn)一步研究可望找到JAK2V617突變陰性MPN的分子治療靶標(biāo)。

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（收稿日期：2015-06-12 本文編輯：蘇 暢）