張輝等

[摘要] 目的 觀察不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力及ALS mRNA表達(dá)，以期揭示口腔白色念球菌感染機(jī)制。 方法 將白色念珠菌3683、SC5314、3630與來(lái)源于50名健康志愿者的口腔上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)，采用革蘭陽(yáng)性染色觀察白色念珠菌的黏附能力，采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)白色念珠菌3683、SC5314、3630中ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)情況。采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 結(jié)果 黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細(xì)胞，且菌株3683黏附數(shù)量明顯多于菌株SC5314和菌株3630，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測(cè)到ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)水平均高于菌株SC5314和菌株3630，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)水平均高于菌株SC5314，但兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 不同生物狀態(tài)白色念珠菌的口腔上皮細(xì)胞黏附能力不同，菌株黏附能力的強(qiáng)弱可能與其ALS2及ALS3基因情況表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 白色念珠菌；口腔上皮細(xì)胞；黏附能力；基因表達(dá)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R781 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）09（b）-0016-04

白色念珠菌為條件致病菌，長(zhǎng)居于人體口腔、皮膚、胃腸道等部位，在維持機(jī)體生態(tài)平衡方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)由于免疫抑制劑、抗生素等的廣泛使用，及糖尿病、艾滋病等發(fā)病率的逐年增加，導(dǎo)致患者機(jī)體免疫力低下，菌群失衡，使得白色念球菌大量繁殖，口腔白色念球菌感染率增加。白色念球菌的致病力與其黏附性有關(guān)[1-2]。研究顯示，在小鼠感染模型中，口腔感染念球菌分離株3683、皮膚感染念球菌分離株3630及系統(tǒng)感染血液念球菌分離株SC5314致病能力差異較大，各菌株的黏膜黏附力不同可能是影響其致病能力的原因之一[3]。ALS基因家族主要編碼白色念珠菌細(xì)胞壁表面的糖蛋白，與白色念珠菌和宿主間的黏附性密切相關(guān)。有研究證實(shí)，白色念球菌ALS基因在生物膜中的表達(dá)升高[4-5]。本研究刮取人口腔上皮細(xì)胞，并與白色念珠菌3683、SC5314、3630混合培養(yǎng)，檢測(cè)不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞黏附能力及ALS mRNA表達(dá)情況，以期觀察不同白色念珠菌致病力的差異，探討其感染作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

白色念珠菌3683、SC5314、3630購(gòu)自于ATCC；人口腔上皮細(xì)胞來(lái)源于50名健康志愿者。

1.2 試劑與儀器

沙堡液體培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青霉素、鏈霉素及胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；EDTA及細(xì)胞計(jì)數(shù)板購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogenin公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物購(gòu)自上海生工；搖床購(gòu)自德國(guó)UniEquip公司；ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀、ABI 9700 PCR儀及ABI 7500全自動(dòng)熒光定量均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 白色念珠菌培養(yǎng)

將白色念珠菌3683、SC5314、3630接種于20 mL沙堡液體培養(yǎng)基中，于搖床培養(yǎng)18 h（37℃，200 r/min）。收集細(xì)菌，PBS洗2次，調(diào)整菌密度為1×107個(gè)/mL。

1.4 人口腔上皮細(xì)胞獲取及培養(yǎng)

以細(xì)胞刮棒刮取來(lái)自浙江省溫嶺市第一人民醫(yī)院的50名健康志愿者口腔上皮細(xì)胞，PBS洗兩次，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。

1.5 黏附能力檢測(cè)

將口腔上皮細(xì)胞與白色念珠菌3683、SC5314、3630以1∶100比例混合置于6孔板內(nèi)，在搖床中孵育1 h（37℃，100 r/min）。行革蘭陽(yáng)性染色，顯微鏡下隨機(jī)選擇50個(gè)口腔上皮細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)口腔上皮細(xì)胞上黏附的白色念珠菌數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。黏附能力計(jì)算為念球菌數(shù)/口腔上皮細(xì)胞數(shù)。

1.6 熒光定量RT-PCR

1.6.1 白色念珠菌

白色念珠菌培養(yǎng)同“1.3”項(xiàng)下，PBS洗3次，調(diào)整菌密度為2×106個(gè)/mL。

1.6.2 口腔上皮細(xì)胞

細(xì)胞獲取同“1.4”項(xiàng)下，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔接種于6孔板。

1.6.3 共培養(yǎng)及觀察

將口腔上皮細(xì)胞與白色念珠菌3683、SC5314、3630分別以1∶10比例混合，RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于6孔板，每孔1.5 mL，培養(yǎng)6 h，光學(xué)顯微鏡觀察后，收集細(xì)胞，離心，置于-80℃冰箱保存。

1.6.4. 引物設(shè)計(jì)

ALS2：上游引物：5'-CCA AGT ATT AAC AAA GTT TCA ATC ACT TAT-3'，下游引物：3'-TCT CAA TCT TAA ATT GAA CGG CTT-5'，引物長(zhǎng)度為366 bp。

ALS3：上游引物：5'-CCA CTT CAC AAT CCC CAT C-3'，下游引物：3'-CAG CAG TAG TAG TAA CAG TAG TAG TTT CAT C-5'，引物長(zhǎng)度為342 bp。

GAPDH：上游引物：5'-TTG ACG GTC CAT CCC ACA A-3'，下游引物：3'-GGA ATA ACC TTA CCA ACG GCT TT-5'，引物長(zhǎng)度為103 bp。

1.6.5 總RNA提取

用預(yù)冷的DEPC水1 mL清洗白色念珠菌，置于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，靜置5 min；加入0.2 mL氯仿，蓋緊EP管，上下傾倒15 s，室溫靜置2～3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清；加入0.5 mL異丙醇，-20℃放置1 h，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清；75%乙醇洗2次，4℃ 12000 r/min離心5 min，棄上清，吸取殘存乙醇；無(wú)菌臺(tái)干燥5～10 min，加DEPC水溶解，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.6 RNA純度檢測(cè)

應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度，分別測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)下RNA的吸光度，計(jì)算A260/A280，若比值在1.8～2.0之間則提示RNA質(zhì)量較好。

1.6.7 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系為5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 2 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、dNTP 2 μL、RNase free dH2O 7.5 μL、OligodT 1 μL、Mgcl2 4 μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL、RNA模板2 μL，反轉(zhuǎn)錄體系共計(jì)20 μL；混勻后置于PCR儀中，反應(yīng)條件為：42℃ 1 h，99℃ 5 min；得到cDNA模板，置于-20℃保存。

1.6.8 熒光定量PCR

1.6.8.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品：預(yù)實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下切割目的條帶。采用回收試劑盒回收純化。利用A260測(cè)得值和片段長(zhǎng)度計(jì)算其濃度，作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。陰性標(biāo)準(zhǔn)品：采用滅菌雙蒸水。

1.6.8.2 反應(yīng)體系 5×SYBR Green Ⅰ PCR buffer 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶1 μL，cDNA或陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品1 μL，ddH2O 35 μL，反應(yīng)體系共計(jì)50 μL。

1.6.8.3 反應(yīng)條件 95℃ 3 min，95℃ 30 s，50℃ 45 s，共行42個(gè)循環(huán)。

1.6.8.4 數(shù)據(jù)測(cè)定 反應(yīng)結(jié)束后，電腦分析結(jié)果，RNA表達(dá)=目的基因拷貝數(shù)/GAPDH基因拷貝數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力

白色念珠菌3683、SC5314、3630與口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)1 h后，革蘭染色結(jié)果顯示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細(xì)胞，且菌株3683黏附數(shù)量（15.74±0.83）明顯多于菌株SC5314（13.04±0.62）和菌株3630（13.11±0.57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)情況

念珠菌口腔與上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀察顯示口腔上皮細(xì)胞形態(tài)完整，周?chē)じ接邪咨钋蚓糠旨?xì)胞已破裂為細(xì)胞碎片?；驒z測(cè)結(jié)果顯示，混合培養(yǎng)6 h后，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測(cè)到ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)率均高于菌株SC5314和菌株3630，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)水平均高于菌株SC5314，但兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

3 討論

白色念球菌是人體重要的機(jī)會(huì)致病菌，調(diào)查表明，近年白色念球菌的檢出率逐年升高，其導(dǎo)致的醫(yī)院感染排在第4位，且死亡率高達(dá)50%左右[6-7]。研究已經(jīng)證實(shí)，黏附性為白色念球菌的致病機(jī)制之一[8]。過(guò)往白色念球菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附性研究較多，但不同生物狀態(tài)白色念珠菌黏附性的差異鮮有報(bào)道。本研究觀察白色念珠菌3683、SC5314、3630對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力，對(duì)治療選擇的臨床指導(dǎo)意義重大。

本研究黏附實(shí)驗(yàn)是將白色念珠菌與口腔上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察一定時(shí)間后每個(gè)口腔上皮細(xì)胞黏附白色念珠菌數(shù)，該方法可直觀證明菌株的黏附力，且操作簡(jiǎn)單[9]。本研究黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮細(xì)胞，且菌株3683黏附數(shù)量明顯多于菌株SC5314和菌株3630，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而菌株SC5314和菌株3630黏附數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。提示白色念珠菌株3683的黏附力最強(qiáng)，其對(duì)口腔的致病力最強(qiáng)。導(dǎo)致不同生物狀態(tài)白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞黏附能力差異的原因有待進(jìn)一步分析。Zhao等[10]研究證實(shí)，野生型白色念球菌株（CA112）、剔除ALS3基因的白色念球菌株（als3/als31843）及剔除了ALS1基因的白色念球菌株（als1/als11467）對(duì)頰上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮包被的細(xì)胞培養(yǎng)板的黏附作用不同，其中，菌株als3/als31843對(duì)頰上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附數(shù)明顯較低，而菌株als1/als11467僅對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力較低。該結(jié)果提示了ALS家族基因功能的差異性及ALS3基因可能參與了白色念珠菌的黏附作用機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，ALS家族各基因的功能不同[11-12]。一項(xiàng)對(duì)陰道念球菌感染的研究發(fā)現(xiàn)，雖然在感染過(guò)程中ALS家族各基因均檢出，但ALS3基因的檢出率最高[13]。小鼠口腔念球菌感染模型初期檢測(cè)顯示，ALS1～4均可檢出，提示其在念球菌感染初期已表達(dá)[14-15]。本研究結(jié)果顯示，念珠菌口腔與上皮細(xì)胞混合培養(yǎng)6 h，白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能檢測(cè)到ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)，其中，菌株3683 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)率均高于菌株SC5314和菌株3630，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；菌株3630 ALS2及ALS3 mRNA表達(dá)率均高于菌株SC5314，但兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)合本研究黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，白色念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞的黏附能力與菌株中ALS2及ALS3基因的表達(dá)強(qiáng)弱有關(guān)，其中黏附能力強(qiáng)的菌株3683其ALS2及ALS3基因表達(dá)水平高。提示ALS2及ALS3基因高表達(dá)可能為口腔白色念球菌感染致病機(jī)制之一。