謝瑩+劉陽+潘素麗+陳宏宇+趙婷婷王傲雪

摘要：以加工番茄有離層品種09872和無離層品種08003為試驗材料，分別提取基因組DNA及有離層品種09872的花梗離區(qū)總RNA，設(shè)計引物擴增并測序，得到JOINTLESS基因序列（1286bp）、jointless（j）突變序列（347bp）及JOINTLESS基因表達(dá)序列（797bp）。采用生物學(xué)軟件對序列進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種相比，有2個堿基發(fā)生突變；jointless（j）突變是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JOINTLESS基因共編碼265個氨基酸，預(yù)測所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

關(guān)鍵詞：加工番茄；離區(qū)；JOINTLESS基因；突變；序列分析

中圖分類號：S641.203文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0030-04

加工番茄是普通番茄的一個栽培種[1]。隨著番茄加工產(chǎn)業(yè)的興起和快速發(fā)展，作為專門用于加工的番茄品種，以其果皮厚、耐儲運、番茄紅素含量高以及矮化自封頂、免去整枝搭架的麻煩等特點而越來越受到人們的重視。番茄的落花落果特性嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，無離層番茄品種不僅可以改善番茄生長過程中外界環(huán)境引起的落花落果情況，保證番茄產(chǎn)量；而且可以提高機械收獲和后續(xù)加工效率，同時，可以減少運輸過程中果柄對果實造成的機械損傷，對提高果實品質(zhì)也具有一定的意義。

目前，對番茄花梗離區(qū)的研究已成為熱點，并取得重要突破。番茄離區(qū)發(fā)育控制基因J（JOINTLESS）是MADS-box基因家族的一員，它的突變會引起番茄果柄或花柄離區(qū)的消失。1994年Wing等報道，通過構(gòu)建遺傳和物理圖譜，以TG523作探針，用Southen雜交，將J定位在番茄細(xì)菌人工染色體TY142不足50kb的片段內(nèi)[2]，并報道首次分離了與離區(qū)發(fā)育直接相關(guān)的基因J[3]。通過重組與反義抑制試驗，肯定J是一個新的LeMADs-box基因，轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的時空模式顯示，J在花柄離區(qū)發(fā)育中的特異性是轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)的，轉(zhuǎn)基因互補試驗證實番茄果實離區(qū)正是由這個基因控制的[4]。本試驗通過對加工番茄無離層突變的原因及加工番茄中JOINTLESS基因序列進行分析，從分子水平闡述無離層突變發(fā)生的原因，以期為無離層加工番茄品種的選育及應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料試驗于2012年秋季在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站進行，有離層加工番茄品種09872和無離層加工番茄品種08003均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組提供，并于日光溫室內(nèi)進行正常栽培管理。選取番茄植株幼嫩葉片，裝入1.5mL離心管內(nèi)，投入液氮中冷凍5min，于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2載體與菌株pMD18-T購于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)DH5α購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1JOINTLESS基因片段的克隆采用CTAB法分別提取有離層品種09872（J）和無離層品種08003（j）的基因組DNA。根據(jù)NCBI基因序列AF275345，用Primer5.0軟件設(shè)計引物F：5′-ATAGGGTAGAGAGGTTTTTTCC-3′，R：5′-CGTAGGCTAAAAGGCGTAG-3′。PCR反應(yīng)體系為buffer（Mg2+）5μL、2.5mmol/LdNTP4μL、引物R2μL、引物F2μL、模板DNA1μL、5U/μLTaq1μL、ddH2O35μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃5min，40個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速純化/回收試劑盒回收純化目的片段，并按原體系進行二次擴增；將二次擴增的產(chǎn)物與pMD18-TVector載體重組連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并選擇陽性克隆送生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2花梗部JOINTLESS基因cDNA克隆取有離層品種09872（J）植株幼嫩的花梗區(qū)，采用Trizol法（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（Promega公司的M-MLV），根據(jù)NCBI基因序列AF275345，用Primer5.0軟件設(shè)計引物F：5′-TCCCTCTTTCTTCAACTCTC-3′，R：5′-ATCTCATGTATTCGTCCCATAG-3′。PCR獲得JOINTLESScDNA片段，PCR反應(yīng)體系為buffer（Mg2+）5μL、2.5mmol/LdNTP4μL、引物R2μL、引物F2μL、模板DNA1μL、5U/μLTaq1μL、ddH2O35μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃1min，55℃30s，72℃5min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。cDNA片段回收擴增，T載體連接、陽性克隆篩選并測序。

1.2.3生物信息學(xué)分析測序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫Blast軟件進行比對分析，利用DNAMAN5.0軟件進行同源性及蛋白相似性分析，采用NCBI的ProteinConservationDomain程序分析蛋白質(zhì)氨基酸結(jié)構(gòu)。采用Protscale工具對JOINTLESS編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進行分析，使用Sopma分析JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)，利用Phyre對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，使用DNAMAN5.0軟件對JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2結(jié)果與分析

2.1加工番茄無離層突變分析

本試驗采用CTAB法提取有離層品種09874與無離層品種08003的基因組DNA，用同一對引物對基因片段進行PCR擴增。由圖1、圖2可見，所得DNA片段長度相差1000bp左右?？梢?，無離層品種（j）在此段內(nèi)必有一段基因缺失，其缺失片段的長度為1000bp左右。

測序獲得加工番茄有離層品種的JOINTLESS基因片段序列長為1286bp，無離層品種的突變序列只有347bp，這2個序列經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，無離層品種的JOINTLESS基因從第150位到第1089位共939bp的堿基發(fā)生缺失（圖3）。將JOINTLESS基因與其cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，JOINTLESS基因的起始密碼子位于JOINTLESS基因的第816位堿基（圖4），而這一表達(dá)起始位置恰好位于無離層品種缺失的部分。因此，加工番茄無離層品種的突變，是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的。

2.2加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1JOINTLESScDNA序列比對分析經(jīng)DNAMAN5.0軟件分析，測序得出的加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列與GenBank提交的cDNA序列的同源性高達(dá)99.75%（圖5），蛋白序列（AF275345）相似性為97.75%。加工番茄JOINTLESS基因共編碼265個氨基酸，其cDNA序列并沒有發(fā)生插入與缺失，只是個別堿基發(fā)生突變，這些突變并沒有使其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。

2.2.2加工番茄JOINTLESS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析通過NCBI的ProteinConservationDomain程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對加工番茄JOINTLESS全長cDNA序列編碼的265個氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，加工番茄JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物屬于MADS基因家族typeⅡ類型中的一員（圖6），其蛋白分子質(zhì)量為30.43ku，等電點為7.38794。

2.2.3JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析用Protscale工具（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進行分析，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強、分值越高疏水性越強的規(guī)律，由圖7可以看出，整個蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.144，最小值為-3.200，在整個肽鏈中親水性氨基酸大量分布其中，整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.4JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析用Sopma（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，JOINTLESS的二級結(jié)構(gòu)中53.21%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.83%為不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，10.19%為β折疊結(jié)構(gòu)，3.77%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖8）。

2.2.5JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)分析利用Phyre的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測功能（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并利用Rasmol軟件對三級結(jié)構(gòu)圖形化分析。由圖9可見，JOINTLESS的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有50個氫鍵，3個α螺旋結(jié)構(gòu)，2個β折疊結(jié)構(gòu)和8個轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.3加工番茄JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖10可見，加工番茄JOINTLESS基因與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

3結(jié)論與討論

對加工番茄無離層品種的jointless突變分析可知，突變是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的，這個片段的缺失會直接導(dǎo)致其丟失啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，同時喪失轉(zhuǎn)錄功能從而不能形成功能蛋白。Mao等也在番茄自然突變體j中發(fā)現(xiàn)，由于啟動子區(qū)段的一段DNA缺失引起J轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致翻譯的蛋白失去功能，最終使番茄的花柄離區(qū)發(fā)育受到影響，不能形成正常的離區(qū)[4]。

JOINTLESS基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，酵母雙雜交表明，JOINTLESS蛋白可以與一系列MADS-box蛋白形成蛋白復(fù)合物[5]，這說明J作為MADS-box家族的一員，在高等

植物MADS-box基因?qū)χ参锘虻恼{(diào)控中，大多數(shù)以形成復(fù)合體來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，篩選與J互作的蛋白，同時，JOINTLESS作為調(diào)控因子，其功能并不是單一控制離區(qū)的發(fā)育和形成。在番茄中J對于花序分生組織特異性和每個花序分生組織花原基的保守性是必需的，這一新功能的發(fā)現(xiàn)也許會為進一步研究J甚至是整個MADS-box基因家族調(diào)控花的發(fā)育機制提供新的思路。

另外，對加工番茄有離層品種JOINTLESS基因的cDNA序列分析可知，與普通栽培品種相比，加工番茄JOINTLESS基因的保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生變化，而且基因序列也沒有發(fā)生插入與缺失，只是2個堿基不同，這可能是同物種不同品種間特有的差異所導(dǎo)致，但也不排除在PCR擴增時堿基發(fā)生錯配的可能。

總之，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種的相比，發(fā)生2個堿基的突變，而jointless（j）突變則是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JONINTLESS基因共編碼265個氨基酸，預(yù)測所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性；經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

參考文獻：

[1]蔣先明.蔬菜栽培學(xué)各論[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：17-21.

[2]WingRA，ZhangHB，TanksleySD.Map-basedcloningincropplants.Tomatoasamodelsystem：Ⅰ.Geneticandphysicalmappingofjointless[J].MolGenGenet，1994，242（6）：681-688.

[3]ZhangHB，MartinGB，TanksleySD，etal.Map-basedcloningincropplants：tomatoasamodelsystemⅡ.Isolationandcharacterizationofasetofoverlappingyeastartificialchromosomesencompassingthejointlesslocus[J].MolGenGenet，1994，244（6）：613-621.

[4]MaoL，BegumD，ChuangHW，etal.JointlessisaMADS-boxgenecontrollingtomatoflowerabscissionzonedevelopment[J].Nature，2000，406（6798）：910-913.

[5]LesebergCH，EisslerCL，WangX，etal.InteractionstudyofMADS-domainproteinsintomato[J].JournalofExperimentalBotany，2008，59（8）：2253-2265.

2結(jié)果與分析

2.1加工番茄無離層突變分析

本試驗采用CTAB法提取有離層品種09874與無離層品種08003的基因組DNA，用同一對引物對基因片段進行PCR擴增。由圖1、圖2可見，所得DNA片段長度相差1000bp左右。可見，無離層品種（j）在此段內(nèi)必有一段基因缺失，其缺失片段的長度為1000bp左右。

測序獲得加工番茄有離層品種的JOINTLESS基因片段序列長為1286bp，無離層品種的突變序列只有347bp，這2個序列經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，無離層品種的JOINTLESS基因從第150位到第1089位共939bp的堿基發(fā)生缺失（圖3）。將JOINTLESS基因與其cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，JOINTLESS基因的起始密碼子位于JOINTLESS基因的第816位堿基（圖4），而這一表達(dá)起始位置恰好位于無離層品種缺失的部分。因此，加工番茄無離層品種的突變，是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的。

2.2加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1JOINTLESScDNA序列比對分析經(jīng)DNAMAN5.0軟件分析，測序得出的加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列與GenBank提交的cDNA序列的同源性高達(dá)99.75%（圖5），蛋白序列（AF275345）相似性為97.75%。加工番茄JOINTLESS基因共編碼265個氨基酸，其cDNA序列并沒有發(fā)生插入與缺失，只是個別堿基發(fā)生突變，這些突變并沒有使其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。

2.2.2加工番茄JOINTLESS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析通過NCBI的ProteinConservationDomain程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對加工番茄JOINTLESS全長cDNA序列編碼的265個氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，加工番茄JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物屬于MADS基因家族typeⅡ類型中的一員（圖6），其蛋白分子質(zhì)量為30.43ku，等電點為7.38794。

2.2.3JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析用Protscale工具（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進行分析，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強、分值越高疏水性越強的規(guī)律，由圖7可以看出，整個蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.144，最小值為-3.200，在整個肽鏈中親水性氨基酸大量分布其中，整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.4JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析用Sopma（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，JOINTLESS的二級結(jié)構(gòu)中53.21%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.83%為不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，10.19%為β折疊結(jié)構(gòu)，3.77%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖8）。

2.2.5JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)分析利用Phyre的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測功能（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并利用Rasmol軟件對三級結(jié)構(gòu)圖形化分析。由圖9可見，JOINTLESS的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有50個氫鍵，3個α螺旋結(jié)構(gòu)，2個β折疊結(jié)構(gòu)和8個轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.3加工番茄JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖10可見，加工番茄JOINTLESS基因與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

3結(jié)論與討論

對加工番茄無離層品種的jointless突變分析可知，突變是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的，這個片段的缺失會直接導(dǎo)致其丟失啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，同時喪失轉(zhuǎn)錄功能從而不能形成功能蛋白。Mao等也在番茄自然突變體j中發(fā)現(xiàn)，由于啟動子區(qū)段的一段DNA缺失引起J轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致翻譯的蛋白失去功能，最終使番茄的花柄離區(qū)發(fā)育受到影響，不能形成正常的離區(qū)[4]。

JOINTLESS基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，酵母雙雜交表明，JOINTLESS蛋白可以與一系列MADS-box蛋白形成蛋白復(fù)合物[5]，這說明J作為MADS-box家族的一員，在高等

植物MADS-box基因?qū)χ参锘虻恼{(diào)控中，大多數(shù)以形成復(fù)合體來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，篩選與J互作的蛋白，同時，JOINTLESS作為調(diào)控因子，其功能并不是單一控制離區(qū)的發(fā)育和形成。在番茄中J對于花序分生組織特異性和每個花序分生組織花原基的保守性是必需的，這一新功能的發(fā)現(xiàn)也許會為進一步研究J甚至是整個MADS-box基因家族調(diào)控花的發(fā)育機制提供新的思路。

另外，對加工番茄有離層品種JOINTLESS基因的cDNA序列分析可知，與普通栽培品種相比，加工番茄JOINTLESS基因的保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生變化，而且基因序列也沒有發(fā)生插入與缺失，只是2個堿基不同，這可能是同物種不同品種間特有的差異所導(dǎo)致，但也不排除在PCR擴增時堿基發(fā)生錯配的可能。

總之，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種的相比，發(fā)生2個堿基的突變，而jointless（j）突變則是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JONINTLESS基因共編碼265個氨基酸，預(yù)測所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性；經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

參考文獻：

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[3]ZhangHB，MartinGB，TanksleySD，etal.Map-basedcloningincropplants：tomatoasamodelsystemⅡ.Isolationandcharacterizationofasetofoverlappingyeastartificialchromosomesencompassingthejointlesslocus[J].MolGenGenet，1994，244（6）：613-621.

[4]MaoL，BegumD，ChuangHW，etal.JointlessisaMADS-boxgenecontrollingtomatoflowerabscissionzonedevelopment[J].Nature，2000，406（6798）：910-913.

[5]LesebergCH，EisslerCL，WangX，etal.InteractionstudyofMADS-domainproteinsintomato[J].JournalofExperimentalBotany，2008，59（8）：2253-2265.

2結(jié)果與分析

2.1加工番茄無離層突變分析

本試驗采用CTAB法提取有離層品種09874與無離層品種08003的基因組DNA，用同一對引物對基因片段進行PCR擴增。由圖1、圖2可見，所得DNA片段長度相差1000bp左右?？梢?，無離層品種（j）在此段內(nèi)必有一段基因缺失，其缺失片段的長度為1000bp左右。

測序獲得加工番茄有離層品種的JOINTLESS基因片段序列長為1286bp，無離層品種的突變序列只有347bp，這2個序列經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，無離層品種的JOINTLESS基因從第150位到第1089位共939bp的堿基發(fā)生缺失（圖3）。將JOINTLESS基因與其cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)，JOINTLESS基因的起始密碼子位于JOINTLESS基因的第816位堿基（圖4），而這一表達(dá)起始位置恰好位于無離層品種缺失的部分。因此，加工番茄無離層品種的突變，是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的。

2.2加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1JOINTLESScDNA序列比對分析經(jīng)DNAMAN5.0軟件分析，測序得出的加工番茄JOINTLESS基因cDNA序列與GenBank提交的cDNA序列的同源性高達(dá)99.75%（圖5），蛋白序列（AF275345）相似性為97.75%。加工番茄JOINTLESS基因共編碼265個氨基酸，其cDNA序列并沒有發(fā)生插入與缺失，只是個別堿基發(fā)生突變，這些突變并沒有使其保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化。

2.2.2加工番茄JOINTLESS基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析通過NCBI的ProteinConservationDomain程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對加工番茄JOINTLESS全長cDNA序列編碼的265個氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，加工番茄JOINTLESS基因編碼產(chǎn)物屬于MADS基因家族typeⅡ類型中的一員（圖6），其蛋白分子質(zhì)量為30.43ku，等電點為7.38794。

2.2.3JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的疏水性和親水性分析用Protscale工具（http：//www.expasy.ch/tools/protscale.html）對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物疏水性和親水性進行分析，依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強、分值越高疏水性越強的規(guī)律，由圖7可以看出，整個蛋白質(zhì)中疏水性最大值是2.144，最小值為-3.200，在整個肽鏈中親水性氨基酸大量分布其中，整體表現(xiàn)為親水性。

2.2.4JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析用Sopma（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明，JOINTLESS的二級結(jié)構(gòu)中53.21%為α螺旋結(jié)構(gòu)，32.83%為不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，10.19%為β折疊結(jié)構(gòu)，3.77%為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（圖8）。

2.2.5JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的三級結(jié)構(gòu)分析利用Phyre的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測功能（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre/）對加工番茄JOINTLESS基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并利用Rasmol軟件對三級結(jié)構(gòu)圖形化分析。由圖9可見，JOINTLESS的蛋白質(zhì)產(chǎn)物含有50個氫鍵，3個α螺旋結(jié)構(gòu)，2個β折疊結(jié)構(gòu)和8個轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

2.3加工番茄JOINTLESS編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的系統(tǒng)發(fā)育分析

由圖10可見，加工番茄JOINTLESS基因與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

3結(jié)論與討論

對加工番茄無離層品種的jointless突變分析可知，突變是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起的，這個片段的缺失會直接導(dǎo)致其丟失啟動子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，同時喪失轉(zhuǎn)錄功能從而不能形成功能蛋白。Mao等也在番茄自然突變體j中發(fā)現(xiàn)，由于啟動子區(qū)段的一段DNA缺失引起J轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，導(dǎo)致翻譯的蛋白失去功能，最終使番茄的花柄離區(qū)發(fā)育受到影響，不能形成正常的離區(qū)[4]。

JOINTLESS基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，酵母雙雜交表明，JOINTLESS蛋白可以與一系列MADS-box蛋白形成蛋白復(fù)合物[5]，這說明J作為MADS-box家族的一員，在高等

植物MADS-box基因?qū)χ参锘虻恼{(diào)控中，大多數(shù)以形成復(fù)合體來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，篩選與J互作的蛋白，同時，JOINTLESS作為調(diào)控因子，其功能并不是單一控制離區(qū)的發(fā)育和形成。在番茄中J對于花序分生組織特異性和每個花序分生組織花原基的保守性是必需的，這一新功能的發(fā)現(xiàn)也許會為進一步研究J甚至是整個MADS-box基因家族調(diào)控花的發(fā)育機制提供新的思路。

另外，對加工番茄有離層品種JOINTLESS基因的cDNA序列分析可知，與普通栽培品種相比，加工番茄JOINTLESS基因的保守結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生變化，而且基因序列也沒有發(fā)生插入與缺失，只是2個堿基不同，這可能是同物種不同品種間特有的差異所導(dǎo)致，但也不排除在PCR擴增時堿基發(fā)生錯配的可能。

總之，加工番茄的JOINTLESS基因編碼序列與普通栽培番茄品種的相比，發(fā)生2個堿基的突變，而jointless（j）突變則是由JOINTLESS基因第1個外顯子的部分序列連同起始密碼子上游共939bp的堿基缺失所引起；JONINTLESS基因共編碼265個氨基酸，預(yù)測所得的蛋白質(zhì)整體表現(xiàn)為親水性；經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析得出，加工番茄JOINTLESS基因序列與矮牽牛中該基因序列相似性最高，與葡萄物種的相似性最低。

參考文獻：

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[3]ZhangHB，MartinGB，TanksleySD，etal.Map-basedcloningincropplants：tomatoasamodelsystemⅡ.Isolationandcharacterizationofasetofoverlappingyeastartificialchromosomesencompassingthejointlesslocus[J].MolGenGenet，1994，244（6）：613-621.

[4]MaoL，BegumD，ChuangHW，etal.JointlessisaMADS-boxgenecontrollingtomatoflowerabscissionzonedevelopment[J].Nature，2000，406（6798）：910-913.

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