李加輔，朱瑞祥，許言文，錢　璇，馬少林

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形科　新疆　烏魯木齊　830054）

·基礎研究·

維吾爾藥異常黑膽質成熟劑總黃酮對增生性瘢痕成纖維細胞增殖及膠原蛋白表達的影響

李加輔，朱瑞祥，許言文，錢璇，馬少林

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形科新疆烏魯木齊830054）

目的：探討維吾爾藥異常黑膽質成熟劑總黃酮（Abnormal savda munziq-total flavonoids，ASMq-TF）對體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞（Hypertrophic scar fibroblasts，HFs）增殖抑制作用及對相關膠原蛋白合成的影響。方法：對HFs進行體外培養(yǎng)并給予不同濃度的ASMq-TF處理，然后，通過CCK-8檢測其細胞增殖情況，通過RT-PCR和Western blot實驗檢測相關膠原蛋白表達。結果：ASMq-TF能夠顯著抑制HFs的增殖及抑制膠原蛋白的表達。討論：本實驗結果表明ASMq-TF通過促進SMAD7合成及減少CollagenⅠ分泌等抑制HFs增殖。［關鍵詞］異常黑膽質成熟劑總黃酮；增生性瘢痕；成纖維細胞；體外培養(yǎng)；膠原蛋白；增殖

創(chuàng)面愈合是一個由多種細胞及細胞因子參與的即復雜又有高度協(xié)調性的過程，大概可以分為三個過程：炎癥期、肉芽組織形成期及重建期，且任何環(huán)節(jié)出錯都會導致不良后果：①創(chuàng)面延遲愈合；②增生性瘢痕；③瘢痕疙瘩[1-4]。增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）作為一種諸如外傷、燒傷、外科手術等創(chuàng)面的過度愈合，越來越多的證據都指出其發(fā)病機制和成纖維細胞的過度增殖，侵襲性加強，膠原蛋白合成增加有關[5-8]。維藥異常黑膽質成熟劑總黃酮（Abnormal savda munziq-total flavonoids，ASMq-TF）是從維藥異常黑膽質成熟劑（Abnormal savda munziq，ASMq）中提取的活性成分[9]。以往的研究結果表明，ASMq具有抑制成纖維細胞增殖，促進其凋亡等作用，可以減輕肝纖維化、肺纖維化等纖維化疾病。國內外已有很多報道，多種黃酮類化合物具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡作用[10-14]。因此本文研究ASMq-TF對HFs的增殖和膠原的合成是否具有抑制作用，旨在進一步解釋ASMq對瘢痕的抑制作用，從而為維藥在臨床預防和治療HS提供相應的理論基礎。

表2　相關引物

1　材料和方法

1.1試劑和化學品

異常黑膽質成熟劑購于新疆維吾爾藥業(yè)有限責任公司（國藥準字：Z65020166），并經水提取分離得到總黃酮（含量為1.62%）；培養(yǎng)基（DMEM），胎牛血清（FBS），胰酶，PBS緩沖液，青霉素和鏈霉素購自于美國Hyclone公司；二甲基亞礬（DMSO）購自美國Sigma-Aldrich公司；細胞增殖及細胞毒性試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8購自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2增生性瘢痕和正常皮膚成纖維細胞來源

本實驗所用5塊HS組織（其中男3例、女2例，均為漢族，年齡23～44歲。平均31.4歲）均來源于整形外科術后切除組織，經病理檢查確診為HS。本實驗中所有患者均無系統(tǒng)性疾病，同時本實驗經新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審議通過，所有提供標本患者均簽署知情同意書。

1.3細胞培養(yǎng)及處理

將術中切取的組織標本，在超凈臺內以無菌PBS液漂洗2遍，去除殘留的血液及其他混雜異物，小心仔細的切除表皮及脂肪組織，將組織標本修剪成小塊，均勻接種于100mm細胞培養(yǎng)皿（美國Corning公司），而后緩慢加入含胎牛血清（體積分數10%）及青霉素（100U/ml）和鏈霉素（100μg/ml）的DMEM培養(yǎng)液，于37℃，含CO2（體積分數為5%）及飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d更換一次培養(yǎng)基。大約7～9d成纖維細胞從組織塊周圍爬出，待組織塊周圍細胞長成致密單層后，取出培養(yǎng)皿中組織塊并用胰酶將細胞消化并進行傳代培養(yǎng)，選擇3～6代的細胞用于實驗研究。在筆者以下的實驗中HFs在加藥干預前均經過無血清DMEM 24h均一化處理，然后在加入含10%FBS的DMEM進行下面的實驗。

1.3.1細胞分組：將處于對數生長期的3～6代的HFs分為：①空白對照組：加入等體積的培養(yǎng)液；②實驗組：分別加入濃度為320、340、360、380、400μg/ml的ASMq-TF；③陽性對照組：加入濃度為250μg/ml的5-FU氟尿嘧啶（5-FU）。每組設 3個平行復孔，以便觀察與檢測。各組于加藥48h后進行觀察及實驗。

1.3.2 CCK-8法檢測ASMq-TF、5-FU對細胞增殖的抑制作用：對處于對數生長期的細胞進行計數，HFs經傳代后以5×103個/孔細胞數接種于96孔板中，并加入200μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)，待細胞貼壁后用無血清的DMEM饑餓過夜進行均一化處理；根據實驗分組設計，加藥干預細胞，每組設3個復孔。連續(xù)檢測加藥后第1天至第11天同一時間點的各組細胞增殖情況，于檢測前4h每孔各加入20μl的CCK-8工作液，置于37℃、體積分數5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后用酶標儀讀取各孔在490nm處光波波長的吸光值（OD值），實驗重復3次，取平均值，后繪制各組的HFs的生長曲線。

1.3.3逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）：將HFs以5×104個接種在60mm培養(yǎng)皿中，經預設方法干預24h后應用Trizol（美國TriPure Isolation Reagent公司）液裂解細胞，后經氯仿、異丙醇進一步提取經過處理的成纖維細胞總mRNA，用紫外分光光度儀分別測定波長為260nm和280nm的光密度值，確定RNA含量和純度。相關引物設計如下（詳見表2），用反轉錄試劑盒（美國Thermo公司）進行cDNA的合成，PCR擴增產物10μl在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，而后對凝膠進行圖像的采集，用Photoshop讀取灰度值。

1.3.4 Western blot檢測Smad7及膠原的表達：將實驗細胞以2×105個接種于直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，加入不同藥物培養(yǎng)后，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）對提取的總蛋白進行定量，后對蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），在將蛋白轉移到PVDF膜（美國Roche公司）上并用5%的脫脂奶粉封閉，相關一抗如下：Collagen I、SMAD7、GAPDH（美國Santa Cruz公司），用BCA蛋白定量分析試劑盒（美國Pierce公司）對一抗孵育后的PVDF膜進行二抗孵育及化學顯色，最后用Quantity One軟件（美國Bio-Rad公司）采集圖像，用Photoshop讀取灰度值。

1.4統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計軟件采用SPSS 11.5，實驗所得數據以x±s表示，各組間比較采用t檢驗，實驗所得數據以表示，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2　結果

2.1 CCK-8檢測HFs的增殖活性

圖1　CCK8法檢測不同處理組HFs的增殖情況

圖2　RT-PCR檢測CollagenⅠmRNA表達情況

圖3　RT-PCR檢測SMAD7 mRNA表達情況

見圖1，可以看出：與空白對照組相比，不同濃度ASMq-TF組及5-Fu組的HFs增殖活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？瞻讓φ战MOD值在第10天達到檢測上限值3.5，隨著實驗組藥物濃度增加，對HFs的抑制作用增強，在320～400μg/ml濃度間具有藥物濃度依賴性?？瞻讓φ战M細胞總數在第10天達到平臺期，320μg/ml ASMq-TF組在第10天達到平臺期，但其細胞總數較空白對照組少。340μg/mlASMq-TF組細胞數在第7天開始下降，360μg/mlASMq-TF組在第6天開始有所減少，380μg/mlASMq-TF組在第 5天即開始減少；400μg/mlASMq-TF組在第3d即開始減少；5-Fu組在第2天開始減少。實驗表明，ASMq-TF和5-Fu作用類似，對HFs具有增殖抑制作用，這一抑制作用表現出濃度時間依賴性（P＜0.05），和空白對照組相比，ASMq-TF濃度為340～380μg/ml時抑制作用較明顯（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR檢測各預設組HFs相關mRNA水平變化

見圖2、3。圖2及圖3表明：實驗組和空白對照組相比，ASMq-TF能抑制CollagenⅠmRNA水平的表達、促進SMAD7 mRNA的表達，且都具有濃度依賴性（P＜0.05）。實驗組和陽性對照組表明：本實驗中ASMq-TF和5-Fu在CollagenⅠmRNA的表達水平上表現出相似的抑制作用，同時兩者對SMAD7 mRNA的表達都具有促進作用。

2.3 Western blot檢測不同處理組相關蛋白的表達水平

見圖4、5。如圖4所示：和空白對照組相比實驗組ASMq-TF表現出和陽性對照組類似的抑制HFs CollagenⅠ蛋白表達的作用（P＜0.05）。相對于空白對照組，實驗組中ASMq-TF能夠上調HFs SMAD7蛋白的表達水平（P＜0.05），且具有濃度依賴性；陽性對照組表現出實驗組類似的作用（P＜0.05），見圖5。

圖4　Western blot檢測各組CollagenⅠ蛋白表達情況

圖5　Western blot檢測實驗各組SMAD7蛋白表達情況

3　討論

HS是一種以成纖維細胞過度增殖和以膠原蛋白為主的細胞外基質過度表達為特點的一種常見皮膚疾病，嚴重影響患者的美觀甚至心理健康，而目前臨床上尚沒有單一的藥物能夠完全防治瘢痕的增生[15]。筆者的實驗通過研究ASMq-TF對于HFs的作用，從而為防治增生性瘢痕提出一種新的方法或途徑。

AMSq是維吾爾醫(yī)藥的重要組成部分，由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青蘭子、黑種草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、羅勒子、蜀葵子、茴芹果、駱駝蓬子等13味維藥調制而成。隨著維吾爾醫(yī)學對藥理學和藥效學的不斷研究，ASMq已逐漸得到了越來越多的關注，有研究表明，ASMq-TF對肝癌、淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤細胞有明顯的抑制作用；并可以轉逆肝癌耐藥細胞株Bel/Fu多藥耐藥性，從而抑制癌細胞的增生[12]。本實驗對離體成纖維體細胞培養(yǎng)證實ASMq-TF能夠顯著抑制HFs的增殖，增加SMAD7的表達及顯著降低I型膠原的合成。

SMAD7是一種抑制型蛋白，它能夠阻止SMAD2及SMAD3的磷酸化，進而抑制HFs增殖及降低CollagenⅠ的合成[16]。在目前的研究中筆者發(fā)現ASMq-TF能夠明顯增加HFs中SMAD7的表達，提示部分阻斷TGF-β/SMAD通路可能是ASMq-TF的作用機制之一，然而具體機制尚有待于更深一步的研究。

［1］Daniel Harper，Alistair Young，Clare-Ellen McNaught.The physiology of wound healing［J］.Surgery，2014，32（9）：445-450.

［2］Kaur IP，Sandhu SK，Deol PK，et al.Material Couture for Wound Healing and Regeneration：an Overview［J］.Current Pharmaceutical Design，2015，21（12）：1556-1574.

［3］Falanga V1.Wound healing and its impairment in the diabetic foot［J］.Lancet，2005，366（9498）：1736-1743.

［4］Velnar T1，Bailey T，Smrkolj V.The wound healing process：an overview of the cellular and molecular mechanisms［J］.JInt Med Res，2009，37（5）：1528-1542.

［5］Tredget EE，Levi B，Donelan MB.Biology and principles of scar managementandburnreconstruction［J］.Surgical Clinics of NorthAmerica，2014，94（4）：793-815.

［6］Wolfram D1，Tzankov A，Pülzl P，et al.Hypertrophic scars and keloids--a review of their pathophysiology，risk factors，and therapeutic management［J］.Dermatol Surg，2009，35（2）：171-81.

［7］Wolfram D，Tzankov A，Pulzl P，et al.Hypertrophic scars and keloids--a review of their pathophysiology，risk factors，and therapeutic management［J］.Dermatol Surg，2009，35（2）：171-181.

［8］高偉成，杜金，馬娟，等.維藥異常黑膽質成熟劑對兔耳增生性瘢痕影響的實驗研究［J］.新疆醫(yī)學，2012，42（9）：11-14.

［9］木拉提·克扎衣別克，阿不都熱依木·玉蘇甫，哈木拉提·吾甫爾，等.異常黑膽質成熟劑總黃酮和總酚的含量測定［J］.李時珍國醫(yī)國藥，2009，20（3）：519-522.

［10］高偉成，王虎軍，喬星，等.異常黑膽質成熟劑對增生性瘢痕成纖維細胞的影響［J］.中華整形外科雜志，2013，29（6）：418-421.

［11］瑪依努爾·艾力，哈木拉提·吾甫爾，維吾爾藥異常黑膽質成熟劑總黃酮逆轉肝癌細胞耐藥性的作用［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（9）：31-33.

［12］田偉，趙永青，彭海平，等.水杉總黃酮對IGF1誘導的心肌成纖維細胞增殖和膠原合成的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2006，12（4）：286-288.

［13］包俊萍，金明，楊雨民.廣棗總黃酮對體外培養(yǎng)大鼠心臟成纖維細胞I、III型膠原mRNA及蛋白表達的影響［J］.醫(yī)學學報，2014，49（1）：136-141.

［14］Stipcevic T1，Piljac J，Vanden Berghe D.Effect of Different Flavonoids on Collagen Synthesis in Human Fibroblasts［J］. Plant Foods for Human Nutrition，2006，61（1）：29-34.

［15］Nguyen TT，Moon YH，Ryu YB，et al.The influence of flavonoid compounds on the in vitro inhibition study of a human fibroblast collagenase catalytic domain expressed in E.Coli［J］.Enzyme Microb Technol，2013，52（1）：26-31.

［16］Yang Y，Gao X，Wang X，et al.Total Flavonoids of Fructus Chorspondiatis inhibits collagen synthesis of cultured rat cardiac fibroblasts induced by angiotensin II：Correlated with NO/cGMP signaling pathway［J］.Eur J Pharm Sci，2012，47（1）：75-83.

編輯/張惠娟

Effects of total flavone of abnormal savda munziq on the proliferation and collagen synthesis of hypertrophic scar fibroblasts

LI Jia-fu，ZHU Rui-xiang，XU Yan-wen，QIAN-Xuan，MA Shao-lin
（Department of Burns and Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To evaluate in vitro effect of Abnormal savda munziq-total flavonoids on the proliferation and collagen synthesis of human hypertrophic scar fibroblasts（HFs）.Methods HFs was cultured in vitro and treated with different concentrations of ASMq-TF.Then，the cell proliferation was detected by CCK-8.The expression of collagen was detected by RT-PCR and Western blot.Results ASMq-TF can inhibit the proliferation of HFs and inhibit the expression of collagen proteinⅠ. Conclusion The results of this experiment showed that ASMq-TF inhibited the proliferation of HFs by promoting SMAD7 synthesis and reducing Collagen secretionⅠ.

Abnormal savda munziq-total flavonoids；hypertrophic scar；fibroblasts；in vitro；collagen；proliferation

R619+.6

A

1008-6455（2015）23-0031-05

國家自然科學基金，維藥異常黑膽質成熟劑基于TGF-β/Smad通路防治增生性瘢痕機制研究（項目編號：81260291）

馬少林，主任，教授，博士研究生導師；研究方向：增生性瘢痕防治，組織器官缺損修復再造；通信地址：新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市鯉魚山路137號，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院燒傷整形科，郵編：830054

2015-09-18

2015-11-27