韋國(guó)兵，毛 玲，何玲玲，張秀秀

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南昌 330004)

吳茱萸 (FRUCTUS EVODIAE)是蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth、石虎Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吳茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果實(shí)。［1］吳茱萸所含化學(xué)成分類型較多，其中生物堿和檸檬苦素類化合物為其主要有效成分。［2］吳茱萸堿和吳茱萸次堿有鎮(zhèn)痛、抗炎、止嘔、擴(kuò)張血管及強(qiáng)心等作用，另外吳茱萸次堿還有抗胃黏膜損傷的作用。［3］吳茱萸生物堿的含量測(cè)定方法有很多，包括高效液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、紫外分光光度法及高效毛細(xì)管電泳法等，其中高效液相色譜法是測(cè)定生物堿最常用的方法。［4，5］本實(shí)驗(yàn)在中藥制劑含量測(cè)定HPLC方法學(xué)研究的基礎(chǔ)上，［6，7］采用高效液相色譜法建立一種吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿含量測(cè)定的新方法，為吳茱萸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1220型高效液相色譜儀 (美國(guó)Agilent公司)，紫外檢測(cè)器 (美國(guó)Agilent公司);Kromasil 100－5C18ODS2色譜柱 (5μm，250mm×4.6mm，瑞典Kromasil公司);HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋 (國(guó)華電器有限公司);AB104－N電子天平(瑞士METTER公司);KQ－500B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 吳茱萸吳茱萸堿對(duì)照品 (批號(hào):7780－AD7C，使用前置P2O5減壓干燥器中干燥12h以上使用)、吳茱萸次堿對(duì)照品 (批號(hào):BJ9VXX5Z)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙醇、乙酸乙酯為分析純;水為超純水;乙腈為色譜純;吳茱萸藥材購(gòu)自江西樟樹藥材市場(chǎng) (產(chǎn)自吳城GAP藥材種植基地)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源學(xué)科組張壽文老師鑒定為吳茱萸藥材。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 以Kromasil 100－5C18ODS2(5μm，250mm×4.6mm)為色譜柱;流動(dòng)相為乙腈－水 (51:49)，流速:1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):290nm，進(jìn)樣量:10μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取吳茱萸堿、吳茱萸次堿對(duì)照品各約2.5mg，精密稱取，加甲醇溶解并定容至25mL，配成吳茱萸堿的濃度為0.1mg/mL，吳茱萸次堿的濃度為0.1mg/mL。

2.3 樣品溶液的制備 粉碎吳茱萸藥材，取吳茱萸粉末約1.0g，精密稱取，共加入10倍量的100%甲醇，80℃回流提取兩次，第一次加入6倍量的100%甲醇，提取2.0h，第二次加入4倍量的100%甲醇，提取1.0h，放冷，濾過(guò)，濾液在分析前以0.45μm濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣10μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取0.5、1、2、3、4、5mL吳茱萸堿、吳茱萸次堿的對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋并定容至10mL，搖勻，在290nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吳茱萸堿和吳茱萸次堿，進(jìn)樣10μL。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取吳茱萸堿和吳茱萸次堿對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批吳茱萸藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件每份供試品溶液進(jìn)樣10μL，記錄峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份吳茱萸藥材供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算峰面積的RSD。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 精確量取已知濃度的吳茱萸藥材供試品溶液3份，每份0.25 mL，分別加入?yún)擒镙菈A及吳茱萸次堿的對(duì)照品溶液，每一份分別連續(xù)進(jìn)樣3次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。

2.5 樣品的含量測(cè)定 精密稱取吳茱萸樣品1.0g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定吳茱萸堿及吳茱萸次堿的平均峰面積，計(jì)算吳茱萸堿及吳茱萸次堿的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系考察 以對(duì)照品進(jìn)樣量 (X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。研究結(jié)果表明吳茱萸堿的回歸方程為Y=1130.7X+2.9721，r2=0.9998(n=6);吳茱萸堿的回歸方程為Y=916.84X－9.9512，r2=0.9994(n=6);結(jié)果表明吳茱萸堿、吳茱萸次堿在0.1～1.0μg之間線性范圍良好。

3.1.2 精密度試驗(yàn) 吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為2.01%、1.80%(n=6)，見表1，表明精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果表 (n=6)

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為2.09%、1.83%(n=6)，見表2，表明重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表 (n=6)

3.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吳茱萸堿和吳茱萸次堿峰面積的RSD分別為1.54%、1.83%(n=6)，見表3，結(jié)果表明，供試品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表 (n=6)

3.1.5 加樣回收試驗(yàn) 吳茱萸堿加入80%對(duì)應(yīng)含量對(duì)照品溶液的平均回收率為99.08%，RSD為2.27%(n=3);加入100%對(duì)應(yīng)含量對(duì)照品溶液的平均回收率為100.52%，RSD為0.56%(n=3);加入120%對(duì)應(yīng)含量對(duì)照品溶液的平均回收率為101.18%，RSD為2.78%(n=3);吳茱萸次堿加入80%對(duì)應(yīng)含量對(duì)照品溶液的平均回收率為101.92%，RSD為2.44%(n=3);加入100%對(duì)應(yīng)含量對(duì)照品溶液的平均回收率為100.68%，RSD為2.96%(n=3);加入120%對(duì)應(yīng)含量對(duì)照品溶液的平均回收率為98.52%，RSD為2.52%(n=3)。吳茱萸堿和吳茱萸次堿的回收率分別見表4與表5。

表4 吳茱萸堿的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表 (n=3)

表5 吳茱萸次堿的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表 (n=3)

3.2 樣品的含量測(cè)定 根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量，含量測(cè)定結(jié)果見表6。該吳茱萸藥材的吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量均達(dá)到了2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定的0.15%。吳茱萸堿及吳茱萸次堿對(duì)照品、樣品HPLC色譜圖分別如圖1、圖2與圖3，由圖可知2種成分可達(dá)到完全分離。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果表

圖1 吳茱萸堿對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 吳茱萸次堿對(duì)照品HPLC色譜圖

圖3 吳茱萸樣品HPLC色譜圖

4 結(jié)論與討論

4.1 流動(dòng)相及色譜條件的選擇 用高效液相色譜法測(cè)定吳茱萸生物堿的含量的流動(dòng)相多用乙腈－水系 統(tǒng)，［8－10］本 試 驗(yàn) 用 Kromasil 100 － 5C18ODS2(5μm，250mm×4.6mm)為色譜柱，以乙腈－水(47:53)、乙腈－水 (49:51)、乙腈－水 (51:49)為流動(dòng)相在290nm檢測(cè)波長(zhǎng)下分析，綜合分離度、分離時(shí)間，發(fā)現(xiàn)以乙腈－水 (51:49)作為流動(dòng)相分離效果最好，而且分離工作時(shí)間短。

4.2 樣品提取條件的選擇 該試驗(yàn)考察了甲醇、乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑對(duì)吳茱萸生物堿提取率的影響，結(jié)果顯示，以甲醇作為提取溶劑的提取效率更高些。此外，試驗(yàn)還比較了不同提取溫度、不同用量 (倍量)、不同提取時(shí)間、不同甲醇濃度對(duì)吳茱萸生物堿提取率的影響，并設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果見表7。通過(guò)數(shù)據(jù)得到的吳茱萸堿和吳茱萸次堿的提取條件有些不同，因此對(duì)兩種提取條件進(jìn)行比較，最終確定吳茱萸生物堿的提取條件為80℃水浴條件下用10倍量的100%甲醇回流提取兩次，時(shí)間3小時(shí)。

表7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

4.3 結(jié)論 采用Kromasil 100－5C18ODS2(5μm，250mm×4.6mm)為色譜柱，乙腈－水 (51:49)為流動(dòng)相，在290nm檢測(cè)波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定了吳茱萸中吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量。該方法下測(cè)定得出該吳茱萸藥材的吳茱萸堿和吳茱萸次堿的含量均達(dá)到了2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定的0.15%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，可以為吳茱萸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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