龔張斌 徐品初 韓志芬 金國(guó)琴 (上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，上海 20203)

T細(xì)胞功能紊亂是免疫衰老過(guò)程中最顯著的變化之一。衰老機(jī)體細(xì)胞免疫功能衰退，主要表現(xiàn)為白細(xì)胞介素(IL)-2基因表達(dá)下降，出現(xiàn)繼發(fā)性免疫缺陷，感染性疾病、腫瘤等的罹患率和死亡率大幅升高〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)在IL-2基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近包含有多個(gè)CpG結(jié)構(gòu)，它們的甲基化水平對(duì)IL-2基因的表達(dá)具有重要調(diào)節(jié)作用〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察自然衰老“腎虛”大鼠模型IL-2基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化水平的變化，探討左歸丸對(duì)IL-2轉(zhuǎn)錄表觀遺傳修飾調(diào)控的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，清潔級(jí)，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2008-0016。飼養(yǎng)條件:群養(yǎng)，2 只/籠，溫度 18℃ ～22℃，光暗周期 12 h∶12 h。采用組間比較法隨機(jī)分組:① 青年對(duì)照組:6月齡;② 老年對(duì)照組:23月齡;③老年左歸丸組(簡(jiǎn)稱老年左歸組):23月齡。老年左歸組從20月齡起以飲料方式飼喂左歸藥液，連續(xù)3個(gè)月，各鼠用藥劑量為0.5 g生藥/100 g體質(zhì)量，約為臨床成人每千克體質(zhì)量劑量的10倍。青年對(duì)照組、老年對(duì)照組給予正常飲水和飼料。

1.1.2 主要藥物和試劑 左歸丸:按照《景岳全書(shū)卷五十一·新方八陣》原方進(jìn)行配制，熟地24 g、山藥12 g、枸杞12 g、山茱萸 12 g、川牛膝9 g、菟絲子12 g、鹿角膠12 g、龜膠12 g，購(gòu)自上?？禈蛩帢I(yè)有限公司。除鹿角膠、龜膠外，其余成分按原方比例水煎2次，濃縮成劑，將鹿角膠、龜膠烊化，混合此三種藥液，濃縮成膏，濃度2.92 g生藥/g煎膏，－30℃保存。

FITC-抗CD4，兔抗大鼠 CD3、CD28單克隆抗體等購(gòu)自Ebioscience公司。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Epiquik公司。PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 ABI SETPONE PLUS型熒光定量PCR儀，Applied Biosystems，Inc.;BD FACSAria型流式細(xì)胞儀，BD Biosciences公司;Biotek酶標(biāo)儀，Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀分選CD4+T細(xì)胞 大鼠腹腔麻醉，無(wú)菌條件下取脾臟，冰上研磨得單細(xì)胞懸液，應(yīng)用大鼠淋巴細(xì)胞分層液分離淋巴細(xì)胞，抗-CD4-FITC染色，4℃ 30 min，避光。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD4+T細(xì)胞的分選。細(xì)胞純度＞95%，活細(xì)胞＞90%。

1.2.2 抗CD3/抗CD28聯(lián)合刺激CD4+T細(xì)胞 分選得到的細(xì)胞隨機(jī)進(jìn)行刺激處理或無(wú)刺激處理。刺激處理:預(yù)先以5 μg/ml抗-CD3單抗包被24孔培養(yǎng)板。各組CD4+T細(xì)胞用含10%(體積化)熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640溶液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml，加入24孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入200 U/ml的青霉素和 100 μg/ml的鏈霉素，2 μg/ml抗-CD28 單抗，置于含5%CO2、100%濕度、37℃培養(yǎng)箱中，進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)。分別在4、24 h收集細(xì)胞。無(wú)刺激處理細(xì)胞用含10%FBS，200 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640溶液在同樣條件下培養(yǎng)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 Q Real time PCR法檢測(cè)IL-2基因mRNA表達(dá) Trizol Reagent抽提各組各時(shí)間點(diǎn)CD4+T細(xì)胞的總RNA。合成cDNA，采用SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，進(jìn)行q RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系:2 ×SYBR Premix EX TaqTMⅡ10 μl，正、反義引物(10 μmol/L)各 0.8 μl，50 × ROX Reference Dye or Dye Ⅱ0.4 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μl，DEPC 水加至20 μl，混勻，加入 PCR 管中。擴(kuò)增條件:95℃變性30 s;95℃ 5 s，61℃ 退火31 s，共40個(gè)循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。每組待測(cè)樣本均設(shè)立六個(gè)重復(fù)，全部反應(yīng)結(jié)束之后，mRNA的變化值按公式:2-△△Ct〔△△Ct=樣本△Ct－陰性對(duì)照Ct〕進(jìn)行計(jì)算。引物如下:IL-2:正義 agcgtgtgttggatttgactc，反義 atgatgctttgacagatggcta;β-actin:正義:cacccgcgagtacaaccttc，反義:cccatacccaccatcacacc。

1.2.3.2 ELISA法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞DNMTs活性 按照Epiquik試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3.3 特異性甲基化PCR(MSP)法檢測(cè)CD4+T細(xì)胞IL-2基因啟動(dòng)子區(qū)域各CpG位點(diǎn)的甲基化程度 Qiagen DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA(gDNA)。應(yīng)用GenomiPhi DNA Amplification試劑盒(Amersham Bioscience)制備陰性對(duì)照(全部CpG位點(diǎn)均為非甲基化)。應(yīng)用CpG methyltransferase試劑盒(New England BioLab)制備陽(yáng)性對(duì)照(全部CpG位點(diǎn)均為甲基化)。Qiagen methylation-Gold試劑盒處理gDNA，將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不變。以處理后的gDNA為模板進(jìn)行q RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為:2×SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ10 μl，正、反義引物(10 μmol/L)各 0.8 μl，50 ×ROX Reference Dye or DyeⅡ0.4 μl，gDNA 2 μl，DEPC 水加至20 μl，混勻，加入 PCR管中。擴(kuò)增條件:95℃變性 30 s;95℃5 s，61℃ 退火 31 s，共 40 個(gè)循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。每組待測(cè)樣本均設(shè)立六個(gè)重復(fù)。按照以下公式進(jìn)行計(jì)算:2－CtM/(2－CtM+2－CtU)×100%。引物如下:Set1甲基化正義5'-ATTTTGTGTGTAATTAGTTCGTCGT-3'，反義 5'-ACAATTTTAATTCATATAATAAACGCC-3';Set1非甲基化正義5'-ATTTTGTGTGTAATTAGTTTGTTGT-3'，反義 5'-ACAATTTTAATTCATATAATAAACACC-3'。Set2甲基化正義5'-TGTATTTGTATATATTTTATTTTTTTC-3'，反義 5'-AAATACACCAAATTCCTCG-3';Set2非甲基化正義5'-TGTATTTGTATATATTTTATTTTTTTT-3'，反義 5'-AAATACACCAAATTCCTCA-3'。β-actin正義5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，反義5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CD4+T細(xì)胞中IL-2 mRNA的表達(dá)情況 抗-CD3聯(lián)合抗-CD28刺激4 h后，IL-2 mRNA開(kāi)始表達(dá)，但各組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。抗-CD3聯(lián)合抗-CD28刺激24 h后，與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組CD4+T細(xì)胞IL-2 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與老年對(duì)照組比較，老年左歸組IL-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠CD4+T細(xì)胞經(jīng)刺激后IL-2 mRNA表達(dá)的變化(±s，n=6，%)

表1 各組大鼠CD4+T細(xì)胞經(jīng)刺激后IL-2 mRNA表達(dá)的變化(±s，n=6，%)

與青年對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與老年組比較:2)P＜0.05;下表同

0 h 4 h 24 h青年對(duì)照組組別1.576±0.0588.654±1.2380.664±9.74老年對(duì)照組 1.492±0.10710.488±1.3038.673±5.611)老年左歸組 1.271±0.0999.898±1.5747.997±8.572)

2.2 各組大鼠CD4+T細(xì)胞中DNMTs的活性變化 與青年對(duì)照組(2.534±0.29)比較，老年對(duì)照組CD4+T細(xì)胞DNMTs活性(6.342±0.33)顯著升高(P＜0.01)。與老年對(duì)照組比較，老年左歸組DNMTs活性(5.633±0.12)明顯降低(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠CD4+T細(xì)胞刺激后IL-2啟動(dòng)子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化程度變化 見(jiàn)表2?？?CD3聯(lián)合抗-CD28刺激24 h后，IL-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上游Set1區(qū)域:與青年對(duì)照組比較，老年對(duì)照組CpG位點(diǎn)甲基化程度顯著升高(P＜0.01);與老年對(duì)照組比較，老年左歸組CpG位點(diǎn)甲基化程度明顯降低(P＜0.05)。Set2區(qū)域:各組間CpG位點(diǎn)甲基化水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表2 各組大鼠CD4+T細(xì)胞刺激24 h后IL-2啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化水平的變化(±s，n=6，%)

表2 各組大鼠CD4+T細(xì)胞刺激24 h后IL-2啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化水平的變化(±s，n=6，%)

甲基化水平青年對(duì)照組組別 Set1甲基化水平 Set226.795±5.4294.277±3.82老年對(duì)照組 61.488±5.101) 93.533±3.65老年左歸組 54.625±4.472)93.755±4.09

3 討論

IL-2是調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化平衡狀態(tài)的關(guān)鍵因子之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-2基因的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)增齡性下降的特征，與其他報(bào)道一致〔3〕。

IL-2僅在活化的T細(xì)胞中表達(dá)，揭示其轉(zhuǎn)錄受到表觀遺傳修飾的調(diào)控〔4〕。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化，染色質(zhì)重塑，組蛋白修飾，microRNA調(diào)控等多種機(jī)制，其中DNA甲基化研究較為深入〔5〕。IL-2基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近+98～－2.2 kb區(qū)間包含多個(gè)CpG結(jié)構(gòu)，其甲基化水平直接決定IL-2基因的表達(dá)與否〔6〕。DNMTs促進(jìn)CpG甲基化，有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果應(yīng)用甲基化酶抑制劑處理T細(xì)胞，IL-2分泌增多〔7〕。而應(yīng)用抗CD3/抗CD28共刺激后發(fā)現(xiàn)多個(gè)CpG位點(diǎn)出現(xiàn)去甲基化，進(jìn)而激活I(lǐng)L-2基因轉(zhuǎn)錄〔8〕。我們應(yīng)用methprimer軟件對(duì)IL-2啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行甲基化引物的設(shè)計(jì)，將該啟動(dòng)子區(qū)分為兩個(gè)區(qū)域(Set1，Set2)，其中 Set1區(qū)域包括 TSS上游四個(gè) CpG(－306，－434，－544，－547)位點(diǎn)，Set2包括 TSS上游兩個(gè) CpG(－995，－1263)位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在未刺激時(shí)，Set1，Set2區(qū)域的CpG位點(diǎn)均呈現(xiàn)高度甲基化，此時(shí)IL-2基因表達(dá)沉默。當(dāng)CD4+T細(xì)胞受anti-CD3/anti-CD28刺激24 h后，Set1區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化程度明顯降低，導(dǎo)致IL-2基因轉(zhuǎn)錄活化。本研究顯示T細(xì)胞被激活后，DNA相應(yīng)CpG位點(diǎn)發(fā)生去甲基化過(guò)程，使IL-2基因表達(dá)開(kāi)放，以上結(jié)果提示:衰老過(guò)程中，基因啟動(dòng)子區(qū)域特定CpG位點(diǎn)甲基化程度的增高或者去甲基化水平的降低，是導(dǎo)致老年大鼠IL-2基因轉(zhuǎn)錄水平下降的原因之一。

中醫(yī)“腎”的功能、陰陽(yáng)平衡學(xué)說(shuō)與衰老以及免疫調(diào)控之間關(guān)系密切〔9〕。機(jī)體在衰老進(jìn)程中受體內(nèi)外各種致病因素刺激，如果陰陽(yáng)持續(xù)失衡，則加重疾病進(jìn)展。腎寓真陰真陽(yáng)，與人的生、長(zhǎng)、壯、老、已關(guān)系密切。機(jī)體隨衰老腎氣不足、陰陽(yáng)失調(diào)，免疫穩(wěn)態(tài)失衡，最終導(dǎo)致陰陽(yáng)離決，直至死亡。由此可見(jiàn)，陰陽(yáng)虛損失衡是衰老的重要病機(jī)。根據(jù)此理論，張景岳所創(chuàng)左歸丸，重用熟地滋補(bǔ)真陰，為君藥，大量補(bǔ)陰藥中，少佐補(bǔ)陽(yáng)之品，取其“陽(yáng)中求陰”之義，陰陽(yáng)并調(diào)，奏滋陰補(bǔ)腎，填精益髓之效，為補(bǔ)腎之陰陽(yáng)的經(jīng)典方劑〔10〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老年大鼠飲用左歸丸后，DNMTs活性減弱，Set1區(qū)域CpG位點(diǎn)甲基化程度下降，進(jìn)而導(dǎo)致IL-2轉(zhuǎn)錄升高，延緩了細(xì)胞免疫功能退化的進(jìn)程。

免疫調(diào)節(jié)是一種整體調(diào)節(jié)，免疫穩(wěn)態(tài)的失衡是許多疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，與陰陽(yáng)的消長(zhǎng)特性頗有類似之處。陰平陽(yáng)秘是機(jī)體的自穩(wěn)狀態(tài)，陰陽(yáng)平衡是生命過(guò)程中系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)的統(tǒng)一。左歸丸陰陽(yáng)雙調(diào)的治法具有雙向、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)〔10〕，在全方位調(diào)節(jié)衰老機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境的平衡方面具有一定優(yōu)勢(shì)，值得深入研究。

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