張大海

摘 要 通過(guò)實(shí)施“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”教學(xué)，讓學(xué)生學(xué)會(huì)微生物的選擇培養(yǎng)、分離、計(jì)數(shù)等技術(shù)的原理和方法，理解選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基的作用。

關(guān)鍵詞 微生物分離 選擇

1 教材分析與課時(shí)安排

“土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)”是人教版高中生物（選修1）專題2“微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用”的第二個(gè)課題，學(xué)生已學(xué)習(xí)了有關(guān)培養(yǎng)基和無(wú)菌技術(shù)的基本知識(shí)，在掌握使用平板劃線法和稀釋涂布法、分離和純化微生物的實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)上，研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用，并測(cè)定其數(shù)量。其中既有關(guān)于特定菌株的選擇策略等知識(shí)性內(nèi)容，又有土壤溶液的稀釋、菌落數(shù)量統(tǒng)計(jì)等操作性內(nèi)容，難度較大、探究性較強(qiáng)，是培養(yǎng)學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)手操作等科學(xué)探究能力，提高生物科學(xué)素養(yǎng)的好素材。

本課題教學(xué)實(shí)施中的關(guān)鍵在于兩點(diǎn)：① 教師要處理好知識(shí)性內(nèi)容與操作性內(nèi)容的關(guān)系，要讓學(xué)生理解特定菌株的選擇策略，并學(xué)習(xí)有關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法和操作程序;② 處理好課常與課后的關(guān)系。本課題的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間不長(zhǎng)，但是操作前要制備培養(yǎng)基、對(duì)培養(yǎng)基和其他操作用具進(jìn)行滅菌，操作后的培養(yǎng)時(shí)間和對(duì)微生物進(jìn)行觀察則需要較長(zhǎng)時(shí)間，因此需要教師精心設(shè)計(jì)教學(xué)程序，統(tǒng)籌安排教學(xué)時(shí)間。

根據(jù)這一教材特點(diǎn)，本課題教學(xué)可分2個(gè)課時(shí)進(jìn)行，2個(gè)課時(shí)之間應(yīng)留有2 d左右的間隔，以便進(jìn)行微生物的培養(yǎng)與觀察。

2 教學(xué)目標(biāo)

2.1 知識(shí)目標(biāo)

簡(jiǎn)述稀釋涂布平板法分離微生物和進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)原理;說(shuō)出選擇性培養(yǎng)基和鑒別性培養(yǎng)基的用途;歸納分離純化微生物的原理和方法。

2.2 能力目標(biāo)

學(xué)會(huì)制備土壤樣本稀釋液，學(xué)會(huì)用稀釋涂布法將菌樣液接種到固體培養(yǎng)基平板;學(xué)會(huì)用稀釋涂布平板法進(jìn)行微生物數(shù)量測(cè)定的方法。

2.3 情感、態(tài)度與價(jià)值觀目標(biāo)

體驗(yàn)科學(xué)知識(shí)的形成過(guò)程，加深對(duì)科學(xué)本質(zhì)的理解;體會(huì)在實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中合作學(xué)習(xí)的有效性，養(yǎng)成嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。

3 教學(xué)準(zhǔn)備

3.1 土壤樣品的采集以及土壤溶液的配制

為保證實(shí)驗(yàn)取得預(yù)期效果，應(yīng)選擇經(jīng)常施用尿素的農(nóng)田，鏟去表土后采集3～8 cm深度范圍內(nèi)的土壤;回實(shí)驗(yàn)室后，去除土壤中的植物枯枝敗葉及其他雜物，用托盤天平稱取樣品10 g，加入到盛有90 g無(wú)菌水的錐形瓶中，震蕩10 min，即制得101土壤溶液;制備完成后可置于冰箱冷藏室內(nèi)備用（1～2 d）。

3.2 配制培養(yǎng)基并進(jìn)行高壓蒸氣滅菌

配制牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（配方：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，加熱溶解后，加水定容至1 000 mL。如條件具備可用瓊脂糖代替瓊脂）， 分裝到100 mL 帶棉塞的錐形瓶中，每瓶各25 mL。

配制尿素固體培養(yǎng)基（配方：葡萄糖10 g，尿素1 g，KH2PO4 1.4 g，Na2HPO4 ?2.1g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂15 g，加熱溶解后定容至1 000 mL），分裝到100 mL 帶棉塞的錐形瓶中，每瓶各25 mL。

將上述分裝好的兩種培養(yǎng)基、裝有4.5 mL 蒸餾水的帶棉塞試管、裝有99 mL 蒸餾水的250 mL錐形瓶、包裝好的培養(yǎng)皿進(jìn)行高壓蒸氣滅菌。

4 教學(xué)過(guò)程

4.1 導(dǎo)入新課

教師講解：尿素是動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝終產(chǎn)物，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的化肥，但農(nóng)作物并不能直接吸收利用尿素，而有些土壤微生物能產(chǎn)生并分泌脲酶。通過(guò)分解土壤中的尿素為自身和植物生長(zhǎng)提供氮元素，由此引出課題：在特定的土壤中可以分解尿素的微生物的數(shù)量是多少？如何從土壤中的眾多微生物中分離出能分解尿素的微生物？

4.2 分析原理，學(xué)生嘗試進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

教師介紹Taq細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)和選擇過(guò)程，引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)到研究微生物的分離和培養(yǎng)，是研究微生物利用的基礎(chǔ)，而要選擇出符合需要的特定微生物，則要從微生物的生理和代謝特點(diǎn)出發(fā)，創(chuàng)造有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件，同時(shí)抑制或阻止其他微生物的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上，教師引導(dǎo)學(xué)生提出實(shí)驗(yàn)的初步設(shè)想，以尿素為惟一氮源，配制培養(yǎng)基，阻止不能利用尿素的微生物的生長(zhǎng)，從而篩選出分解尿素的微生物。學(xué)生以實(shí)驗(yàn)小組為單位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。由于本實(shí)驗(yàn)的綜合性強(qiáng)，難度大，學(xué)生在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程時(shí)可能存在不少困難。教師一方面要鼓勵(lì)小組內(nèi)部開(kāi)展討論，逐步修正設(shè)計(jì);另一方面也要適時(shí)的參與到各組的討論過(guò)程中，提出合理的建議。

4.3 總結(jié)設(shè)計(jì)結(jié)果，得出可行的實(shí)驗(yàn)流程

讓各小組展示設(shè)計(jì)結(jié)果，組織全體學(xué)生討論，教師給予評(píng)價(jià)，最終得出可行的實(shí)驗(yàn)流程（圖1），并要求學(xué)生明確各步驟的具體目的。根據(jù)教師課前所進(jìn)行的預(yù)實(shí)驗(yàn)，所取的土壤樣品中分解尿素的微生物大約為1.5×108個(gè)/g。因此，可選擇讓學(xué)生進(jìn)行104、105兩種土壤稀釋液的涂布接種。這樣既可保證實(shí)驗(yàn)效果，又減少了器材、試劑的用量，節(jié)約教學(xué)時(shí)間，提高教學(xué)效率。同時(shí)，以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以便讓學(xué)生充分理解和認(rèn)識(shí)選擇性培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)策略和選擇效果。

4.4 學(xué)生分組操作

為節(jié)約教學(xué)時(shí)間，教師可在課前將前期備好的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基，用電磁爐加熱融化后，于課前置于80 ℃的水浴中進(jìn)行保溫，保持融化狀態(tài)，以便學(xué)生及時(shí)取用。

倒平板：將融化的兩種培養(yǎng)基分發(fā)給每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，指導(dǎo)其按規(guī)范倒平板，將兩種融化的固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，每個(gè)100 mL錐形瓶中盛有的25 mL培養(yǎng)基，可倒兩個(gè)平板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組可制得兩種平板共四個(gè)。制作完成后，分別編號(hào)，置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上等待其冷卻凝固。

配制104、105土壤稀釋液：將101土壤溶液和經(jīng)滅菌的裝有4.5 mL 蒸餾水的帶棉塞試管、裝有99 mL 蒸餾水的250 mL錐形瓶分發(fā)給各小組，教師指導(dǎo)學(xué)生制備104、105兩種土壤稀釋液。具體的方法可由教師直接給出，也可由各小組自行討論制定方法，因?qū)W生對(duì)微量移液器的使用不熟悉，教師應(yīng)給予指導(dǎo)。

接種菌液，分離尿素分解菌：教師指導(dǎo)學(xué)生用微量移液器，各取0.1 mL104、105土壤稀釋液，分別加入到裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，使用涂布器，在酒精燈火焰附近打開(kāi)培養(yǎng)皿，將加入的菌液均勻涂布于整個(gè)培養(yǎng)基，蓋上培養(yǎng)皿后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

以上為第一課時(shí)。在第二課時(shí)教學(xué)實(shí)施前，教師可組織學(xué)生定期觀察培養(yǎng)情況。

觀察對(duì)比培養(yǎng)結(jié)果并計(jì)算：2 d后觀察比較牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基中菌落的形態(tài)并計(jì)數(shù)?？梢悦黠@地發(fā)現(xiàn)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)多樣，數(shù)目較多，而且隨稀釋倍數(shù)的增加，菌落的數(shù)目減少。而尿素培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)比較單一，數(shù)目也明顯少于對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落。學(xué)生根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，計(jì)算出土壤中分解尿素的微生物的數(shù)量。例如學(xué)生計(jì)數(shù)在105稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)基上出現(xiàn)的菌落為60個(gè)，則每克土壤中尿素分解菌數(shù)量為60×5×105×10=3×108個(gè)/g。

4.5 小組討論，促進(jìn)學(xué)生對(duì)微生物選擇性培養(yǎng)的理解

學(xué)生完成分組操作后，教師可設(shè)計(jì)問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生鞏固有關(guān)微生物培養(yǎng)的原理和方法，加深其對(duì)微生物選擇性培養(yǎng)的理解。具體問(wèn)題及設(shè)計(jì)意圖如下：

（1） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，提供碳源和氮源的物質(zhì)分別是什么？

（2） 尿素固體培養(yǎng)基中，提供碳源和氮源的物質(zhì)分別是什么？

（3） 你所在的實(shí)驗(yàn)小組的培養(yǎng)結(jié)果如何？按生長(zhǎng)菌落的多少，將4只培養(yǎng)皿排序，從多到少的順序是什么？為何會(huì)出現(xiàn)菌落數(shù)量的差異？

（4） 你所在的實(shí)驗(yàn)小組，實(shí)現(xiàn)了對(duì)土壤中分解尿素的微生物的選擇性培養(yǎng)嗎？為什么？

以上問(wèn)題串從復(fù)習(xí)上一課題介紹的微生物培養(yǎng)過(guò)程中的碳源、氮源入手，讓學(xué)生體會(huì)不同微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中利用的碳源和氮源是不同的，從而引導(dǎo)其深刻理解微生物的選擇性培養(yǎng)的思路，進(jìn)一步掌握特定微生物的選擇和分離的方法。

4.6 設(shè)計(jì)“意外”，引導(dǎo)課題延伸

教師展示學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從中選擇符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期的尿素固體培養(yǎng)基，打開(kāi)培養(yǎng)皿，使用手持式噴壺，向培養(yǎng)基表面噴入事先配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的酚紅試劑，靜置片刻，讓學(xué)生觀察現(xiàn)象。

教師講解并提問(wèn)：酚紅試劑是一種酸堿指導(dǎo)劑，其變色范圍是pH6.8（黃）～8.4（紅），觀察到的培養(yǎng)基上的顏色有何變化？這說(shuō)明了什么問(wèn)題？

學(xué)生通過(guò)觀察可知，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)了兩種不同類型的菌落，一種菌落周圍出現(xiàn)了紅色圈，另一種則呈現(xiàn)黃色。這說(shuō)明這些微生物的種類是不同的，菌落周圍變紅的說(shuō)明微生物培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生了堿性物質(zhì)，而菌落周圍變黃則說(shuō)明產(chǎn)生了酸性物質(zhì)。

教師給出如下資料，指導(dǎo)學(xué)生閱讀：

資料：微生物將含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨的過(guò)程被稱為氨化作用。能進(jìn)行氨化作用的細(xì)菌統(tǒng)稱氨化細(xì)菌。有些氨化細(xì)菌能分泌脲酶，可將尿素分解生成氨，為微生物提供氮源，如脲芽孢八疊球菌。

硝化細(xì)菌可利用氨氧化過(guò)程中釋放的能量，將無(wú)機(jī)物轉(zhuǎn)化成有機(jī)物而營(yíng)自養(yǎng)生活，其中能將氨氧化成亞硝酸鹽的稱為氨氧化細(xì)菌，如亞硝化單胞菌;能將亞硝酸鹽氧化為硝酸的是亞硝酸氧化細(xì)菌，如硝化桿菌等。

教師要求學(xué)生根據(jù)以上資料，進(jìn)一步判斷培養(yǎng)基上出現(xiàn)的兩類菌群，分別是資料所給出的哪一類細(xì)菌。

在此基礎(chǔ)上，教師提出問(wèn)題：本實(shí)驗(yàn)中使用的尿素固體培養(yǎng)基中的惟一氮源是尿素，其目的在于選擇土壤中的分解尿素的微生物，那么為何在培養(yǎng)基中出現(xiàn)了以氨為氮源的氨化細(xì)菌？如果想進(jìn)一步選擇分解尿素的微生物應(yīng)該怎么做？

筆者設(shè)計(jì)這一問(wèn)題串的目的在于幫助學(xué)生理解選擇性培養(yǎng)基和鑒定性培養(yǎng)基的用途。借此問(wèn)題，教師引導(dǎo)學(xué)生認(rèn)識(shí)到，尿素分解菌可將尿素分解為氨，這時(shí)培養(yǎng)基中的氮源的種類就發(fā)生了變化，由原來(lái)的尿素是惟一氮源變成了除尿素外還存在其他的氮源。因此，可在這樣的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，有些是可以分解尿素的，有些則是以氨為氮源的雜菌。而要想選擇出其中分解尿素的微生物，可在配制尿素固體培養(yǎng)基時(shí)加入酚紅起到鑒別作用，然后用滅菌后的接種環(huán)，挑取菌落周圍出現(xiàn)紅色區(qū)域的微生物進(jìn)行接種培養(yǎng)。

4.7 總結(jié)歸納

在總結(jié)歸納階段，教師可設(shè)計(jì)一系列問(wèn)題，引導(dǎo)學(xué)生回顧微生物分離純化的方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路，具體問(wèn)題如下：

（1） 分離純化微生物的方法有哪些？（平板劃線法、稀釋涂布法、選擇培養(yǎng)基分離、鑒別性培養(yǎng)基鑒別后挑取接種）

（2） 本實(shí)驗(yàn)中，為何要設(shè)計(jì)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤微生物的步驟？（設(shè)置對(duì)照，通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基上菌落的數(shù)量和形態(tài)，證明尿素固體培養(yǎng)基的選擇效果）

（3） 要想提高土壤中尿素分解微生物計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，應(yīng)該怎么做？（設(shè)置重復(fù)，取均值，減少實(shí)驗(yàn)誤差）

（4） 請(qǐng)歸納微生物計(jì)數(shù)的方法。（稀釋涂布法、血球計(jì)數(shù)板、比濁法等）

以上教學(xué)過(guò)程充分挖掘了該課題的教學(xué)價(jià)值，使課程標(biāo)準(zhǔn)中“微生物的分離與培養(yǎng)、微生物計(jì)數(shù)、選擇性培養(yǎng)基的選擇作用”等具體要求得到有效落實(shí)，同時(shí)，該教學(xué)過(guò)程較好地處理了知識(shí)性內(nèi)容與操作性內(nèi)容及課堂與課后的關(guān)系，可起到節(jié)約時(shí)間，提高教學(xué)效率的效果。

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