徐姍姍，樸美花，王艷姝，劉　楠，裴愛月，馮春生

(吉林大學第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

異氟醚對Aβ25-35誘導大鼠PC12細胞氧化應激損傷的影響及海藻糖的保護作用

徐姍姍，樸美花，王艷姝，劉楠，裴愛月，馮春生

(吉林大學第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

目的：探討吸入麻醉藥異氟醚對β淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導大鼠PC12細胞氧化應激損傷的影響，闡明海藻糖對其可能的預防及保護作用。方法：將大鼠PC12細胞隨機分為正常對照組(Control組)、異氟醚組(Iso組)、Aβ25-35組(Aβ組)、異氟醚+Aβ25-35組(Iso+Aβ組)、異氟醚+Aβ25-35+海藻糖組(Iso+Aβ+Tre組)和海藻糖組(Tre組)。正常對照組，PC12細胞給予正常細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)；Iso組，PC12細胞給予2%異氟醚；Aβ組，PC12細胞給予10 μmol·L-1Aβ25-35；Iso+Aβ組，PC12細胞給予2%異氟醚和10 μmol·L-1Aβ 25-35；Iso+Aβ+Tre組，PC12細胞給予2%異氟醚、10 μmol·L-1Aβ25-35和200 mmol·L-1海藻糖；Tre組，PC12細胞給予200 mmol·L-1海藻糖。采用MTT法檢測細胞存活率；Hoechst 33342熒光染色檢測細胞凋亡率；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)熒光法檢測細胞中活性氧(ROS)水平；化學發(fā)光法測定細胞中丙二醛(MDA)水平，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及過氧化氫酶(CAT)活性。結(jié)果：與正常對照組比較，Iso組、Aβ組和Iso+Aβ組PC12細胞凋亡率明顯升高(P<0.05或P<0.01)，細胞存活率明顯降低(P<0.05或P<0.01)，細胞中ROS和MDA水平(P<0.05或P<0.01)明顯升高，細胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與Iso和Aβ組比較，Iso+Aβ組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，但細胞存活率明顯降低(P<0.05)，細胞中ROS、MDA水平(P<0.05)明顯升高，細胞中SOD和GSH-Px和CAT活性明顯降低(P<0.05)；與Iso+Aβ組比較，Iso+Aβ+Tre組細胞凋亡率(P<0.05)明顯降低，細胞存活率明顯升高(P<0.05)，細胞中ROS和MDA水平明顯降低(P<0.05)，細胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明顯升高(P<0.05)。結(jié)論：吸入麻醉藥異氟醚能夠加劇Aβ25-35誘導PC12細胞氧化應激損傷和細胞凋亡，海藻糖能夠通過抗氧化和抗凋亡作用拮抗異氟醚的細胞毒性。

異氟醚；阿爾茨海默??；PC12細胞；氧化應激；細胞凋亡；海藻糖

目前全世界每年有800萬阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者經(jīng)歷全身麻醉。動物實驗和臨床研究[1-2]表明：全身麻醉能夠增加AD發(fā)病的風險，加重AD的神經(jīng)病理改變。研究[3-4]顯示：氧化應激和自由基損傷與AD神經(jīng)元凋亡有密切關(guān)聯(lián)。有研究[1,5]證實：臨床相關(guān)濃度的吸入麻醉藥異氟醚能夠誘導神經(jīng)細胞凋亡，加劇AD神經(jīng)病理進程，但其機制是否與氧化應激損傷有關(guān)還有待進一步研究。海藻糖(trehalose)是一種天然的細胞保護劑，具有抗氧化應激損傷能力，可以保護細胞對抗多種有害刺激和損傷(如脫水、氧化應激和高溫等)[6-7]，但海藻糖能否預防和(或)減輕吸入麻醉藥異氟醚對AD的神經(jīng)毒性作用尚不清楚。因此，本研究擬應用β淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)25-35損傷的大鼠PC12細胞體外AD模型，探討異氟醚對Aβ誘導大鼠PC12細胞氧化應激損傷的影響及海藻糖的保護作用。

1　材料與方法

1.1細胞和主要試劑大鼠PC12細胞系由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所提供。高糖DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素、谷氨酰胺、青霉素、磷酸緩沖液(PBS)、胎牛血清、胰蛋白酶和多聚賴氨酸均購自美國Gibco公司；Aβ 25-35、海藻糖、二甲基亞砜(DMSO)、二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)、Hoechst 33342和四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；異氟醚購于美國雅培公司；丙二醛(malondialdehyd,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶(catalase,CAT)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2PC12細胞培養(yǎng)將PC12細胞置于含100 U·mL-1青霉素、10%熱滅活胎牛血清、100 mg·L-1鏈霉素和1%谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)液中，于5%CO2、37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)2 ～ 3 d更換細胞培養(yǎng)液1次，當PC12細胞生長至70%～80%融合時，給予0.25%胰蛋白酶進行消化，細胞傳代培養(yǎng)。

1.3聚集態(tài)Aβ25-35的制備應用無菌去離子水溶解Aβ25-35，配制濃度為1 mmol·L-1的Aβ25-35母液，于-80℃冰箱保存。使用前先將Aβ25-35置于37℃溫箱中孵育5 ～ 7 d使Aβ 25-35達到聚集狀態(tài)，應用細胞培養(yǎng)液稀釋至其終濃度為10 μmol·L-1，保存于4℃冰箱待用。

1.4細胞分組及處理PC12細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別以1.0×105、5.0×104和1.0 ×104mL-1接種于6孔、24孔和96孔細胞培養(yǎng)板，每組6孔。細胞加入含10%胎牛熱滅活血清的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除原細胞培養(yǎng)液，重新加入含1%熱滅活胎牛血清的細胞培養(yǎng)液2 h后，隨機將PC12細胞分為正常對照組(Control組)、異氟醚組(Iso組)、Aβ25-35組(Aβ組)、異氟醚+Aβ25-35組(Iso+Aβ組)、異氟醚+Aβ25-35+海藻糖組(Iso+Aβ+Tre組)和海藻糖組(Tre組)。正常對照組：PC12細胞加入DMEM培養(yǎng)液；異氟醚組：將細胞培養(yǎng)板置于特定的密閉容器中，容器連接麻醉機，持續(xù)通入流量為2 L·min-1的O2，并通過吸入麻醉藥揮發(fā)罐給予2%異氟醚處理，持續(xù)作用6 h；Aβ組：PC12細胞加入Aβ 25-35至終濃度為10 μmol·L-1；Iso+Aβ組：PC12細胞加入10 μmol·L-1Aβ的同時給予2%異氟醚作用6 h；Iso+Aβ+Tre組：PC12細胞預先給予終濃度為200 mmol·L-1海藻糖24 h后，加入10 μmol·L-1Aβ25-35并同時給予2%異氟醚作用6 h；Tre組：PC12細胞加入終濃度為200 mmol·L-1的海藻糖。

1.5PC12細胞凋亡率的檢測應用Hoechst 33342染色法檢測各組細胞凋亡率[8]。PC12細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，按實驗要求給予藥物作用24 h后，細胞經(jīng)PBS清洗3次，加入終濃度為10 mg·L-1的Hoechst33342溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min，PBS清洗3次，細胞經(jīng)1 000×g 離心5 min，去掉上清后，應用熒光顯微鏡檢測細胞核凋亡形態(tài)學。正常PC12細胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色為藍色均勻熒光，凋亡細胞的細胞核呈現(xiàn)顆粒分葉狀或縮小凝固狀藍色明亮熒光。顯微鏡下任意選取6個視野計數(shù)凋亡細胞，每個視野相應的細胞數(shù)大于400個。細胞凋亡率=計數(shù)凋亡細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)× 100%。

1.6PC12細胞存活率的檢測應用MTT法檢測PC12細胞存活率[8]。細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，按實驗要求給予藥物作用24 h后，細胞經(jīng)PBS清洗3次，每孔加入MTT溶液15 μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后去除孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，應用酶標儀在激發(fā)波長570 nm處測定各孔吸光度(A)值。PC12細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.7PC21細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平測定PC12細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，按實驗要求各組細胞進行相應藥物處理24 h后，細胞經(jīng)PBS清洗3次，加入終濃度為10 μmol·L-1DCFH-DA熒光探針溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20 min，PBS清洗3次。細胞經(jīng)1 000×g離心5 min，去掉上清后，應用熒光分光光度計在激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm處檢測細胞內(nèi)DCFH熒光強度。細胞中ROS水平以DCFH平均熒光強度表示。

1.8PC12細胞中MDA水平，SOD、GSH-Px和CAT活性檢測PC12細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，進行相應藥物處理24 h后，細胞經(jīng)PBS清洗3次，離心收集細胞，加入細胞裂解液，提取上清待測，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。PC12細胞中MDA水平和SOD、GSH-Px及CAT活性的測定操作均按照試劑盒說明書進行。MDA水平測定采用硫代巴比妥酸法；SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，以每毫克蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為一個SOD活性單位(U)。采用熒光分光光度計測定各管A值，計算MDA水平，SOD、GSH-Px及CAT活性。

2　結(jié)　果

2.1各組PC12細胞存活率正常對照組PC12細胞存活率為98.1%±2.6%；與正常對照組比較，Iso組、Aβ組和Iso+Aβ組PC12細胞存活率(86.7%±9.5% 、82.8%±11.8%和69.4%±8.3%)降低(P<0.05或P<0.01)；與Iso組和Aβ組比較，Iso+Aβ組PC12細胞存活率明顯降低(P<0.05)；Iso+Aβ+Tre組PC12細胞存活率(91.2% 6.3%)高于Iso+Aβ組(P<0.05)。

2.2各組PC12細胞凋亡率與正常對照組(1.2%±0.2%)比較，Iso組、Aβ組和Iso+Aβ組PC12細胞凋亡率(11.12%±0.27%、16.21%±0.37%和28.74%±0.85%)明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與Iso組和Aβ組比較，Iso+Aβ組PC12細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；Iso+Aβ+Tre組PC12細胞凋亡率(7.32%±0.22%)低于Iso+Aβ組(P<0.05)。見圖1(插頁一)。

2.3各組PC12細胞中ROS水平與正常對照組(165)比較，Iso組(425)、Aβ組(618)和Iso+Aβ組(921)PC12細胞中ROS水平明顯升高；與Iso組和Aβ組比較，Iso+Aβ組PC12細胞中ROS水平明顯升高；與Iso+Aβ組比較，Iso+Aβ+Tre組PC12細胞中ROS水平(223)降低。

2.4各組PC12細胞中MDA水平和SOD、GSH-Px及CAT活性與正常對照組比較，Iso組、Aβ組和Iso+Aβ組PC12細胞中MDA水平明顯升高，SOD、GSH-Px和CAT活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與Iso組和Aβ組比較，Iso+Aβ組PC12細胞中MDA水平明顯升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px和CAT活性明顯降低(P<0.05)；與Iso+Aβ組比較，Iso+Aβ+Tre組和Tre組PC12細胞中MDA水平降低，SOD、GSH-Px和CAT活性升高(P<0.05)。見表1。

表1　各組PC12細胞中MDA水平和SOD、GSH-Px及CAT活性

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05 compared with Aβ group;#P<0.05 compared with Iso group;▲P<0.05 compared with Iso+Aβ group.

3　討　論

氧化應激與AD發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)[9]。研究[10]顯示:Aβ蛋白的異常聚集、ROS的積聚、線粒體的損傷是AD的重要病理因素，其相互影響，共同促進AD病理進程的進展。線粒體作為細胞能量的主要來源，在氧化磷酸化的同時產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物ROS。蓄積的ROS不僅氧化細胞內(nèi)的DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，還能促進蛋白質(zhì)聚集(Aβ蛋白聚集)。Aβ在聚集過程可以產(chǎn)生ROS，加重氧化應激反應，而Aβ的聚集還能直接損傷線粒體，生成過多的ROS[11]。大量的Aβ、ROS和Ca2+進入線粒體，能夠引起線粒體腫脹和膜電位消失，能量生成減少，ROS生成進一步增加，最后引起線粒體破裂，細胞色素C的釋放和凋亡因子的激活，導致神經(jīng)元凋亡。MDA是氧自由基氧化生物膜中的不飽和脂肪酸而形成的脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，MDA 水平能反應出機體氧化應激的程度。SOD、GSH-Px和CAT是體內(nèi)重要的抗氧化酶類，SOD能清除超氧陰離子，而GSH-Px和CAT能特異性地分解SOD，GSH-Px和CAT活性高低反應了機體清除氧自由基能力。本研究結(jié)果顯示：經(jīng)10 μmol·L-1Aβ25-35處理PC12細胞24 h后，細胞凋亡率明顯增加，細胞存活率明顯降低，細胞中ROS水平明顯升高，細胞中MDA水平明顯升高，細胞SOD、GSH-Px、CAT活性明顯降低，表明Aβ25-35能夠引起大鼠PC12細胞氧化應激損傷和細胞凋亡；給予臨床相關(guān)濃度的異氟醚處理PC12細胞24 h后，Iso組細胞凋亡率明顯增加，存活率明顯降低，細胞中ROS水平明顯升高，細胞中MDA水平明顯升高，細胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明顯降低，表明異氟醚也能引起大鼠PC12細胞氧化應激損傷和細胞凋亡；與Aβ組比較，Iso+Aβ組PC12細胞同時應用2%異氟醚和10 μmol·L-1Aβ25-35處理后，細胞凋亡率進一步增加，細胞存活率進一步降低，細胞中ROS和MDA水平進一步升高，細胞中SOD、GSH-Px和CAT活性進一步降低，提示吸入麻醉藥異氟醚能夠明顯加劇Aβ25-35誘導的大鼠PC12細胞氧化應激損傷和凋亡。體外培養(yǎng)的細胞研究[12]結(jié)果表明：臨床相關(guān)濃度的異氟醚能降低細胞存活率，誘導Caspase-3活化、ROS積聚和線粒體功能障礙，減少ATP生成。在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和正常小鼠腦內(nèi)研究[5,13]結(jié)果顯示：異氟醚能增加Aβ的生成，促進ROS產(chǎn)生和細胞色素C的釋放，降低Bcl-2表達，增加Bax表達，誘導Caspase-3活化和凋亡[5,13]，與本研究結(jié)果一致。

海藻糖(C12H22O11)由2個葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷鍵構(gòu)成，是一種化學性質(zhì)穩(wěn)定，無毒性的天然非還原性雙糖，在自然界中廣泛存在于多種植物和非哺乳動物體內(nèi)。海藻糖是一種天然的細胞保護劑，可以保護細胞對抗多種有害刺激和損傷(如脫水、氧化應激和高溫等)[6-7]，還能保存蛋白質(zhì)藥物、人類組織和細胞活性。動物實驗研究[14]表明：海藻糖能改善轉(zhuǎn)基因AD鼠的行為學缺陷程度，減少腦內(nèi)磷酸化Tau和Aβ蛋白聚集，還能夠抑制亨廷頓病轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)多聚谷酰胺的形成，改善其運動功能，并延長其壽命[15]。Yang等[16]發(fā)現(xiàn)：腦內(nèi)移植神經(jīng)干細胞復合海藻糖能夠減輕轉(zhuǎn)基因鼠亨廷頓病模型的神經(jīng)病理過程。本研究結(jié)果顯示：與Iso+Aβ組比較，Iso+Aβ+Tre組和Tre組PC12細胞存活率明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，細胞中MDA水平明顯降低，細胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明顯升高，表明給予海藻糖能夠明顯減輕異氟醚誘導AD細胞模型氧化應激損傷和細胞凋亡，提示海藻糖能夠拮抗吸入麻醉藥異氟醚對AD的細胞毒性。動物實驗研究[17]表明：給予抗氧化劑能夠阻止轉(zhuǎn)基因AD鼠的空間記憶功能的喪失，保護蛋白質(zhì)不受氧化應激性損傷，減少腦內(nèi)Aβ蛋白聚集。海藻糖已經(jīng)被證實是一種有效的天然抗氧化劑。很多研究[6,18]表明：海藻糖能夠保護細胞對抗氧化應激損傷。研究[19-20]顯示:細胞內(nèi)海藻糖能夠?qū)够钚匝醯膿p傷，保護細胞和蛋白質(zhì)的活性，還能夠明顯增強真菌抵抗H2O2引起的氧化應激損傷的能力。Bleoanca等[21-23]發(fā)現(xiàn):海藻糖還能降低由脂質(zhì)過氧化損傷介導的氧化應激反應，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，異氟醚能夠促進Aβ25-35誘導大鼠PC12細胞氧化應激損傷和細胞凋亡，海藻糖能夠通過抗氧化和抗凋亡作用來拮抗異氟醚的細胞毒性。

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Effect of isoflurane on oxidative stress injury induced by Aβ25-35 and protective effects of trehalose in PC12 cells of rats

XU Shanshan,PIAO Meihua,WANG Yanshu,LIU Nan,PEI Aiyue,FENG Chunsheng

(Department of Anesthesiology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo explore the effect of isoflurane on the oxidative stress injury induced by beta-amyloid protein (Aβ) 25-35 in PC12 cells of the rats,and to clarify the possible protective effects of trehalose on this injury.MethodsThe PC12 cells of rats were randomly divided into normal control group (Control group,treated with normal cell culture medium),isoflurane group (Iso group,treated with 2% isoflurane),Aβ25-35 group(Aβ group,treated with 10 μmol·L-1Aβ25-35),isoflurane + Aβ25-35 group (Iso+Aβ group,treated with 2% isoflurane and 10 μmol·L-1Aβ25-35),isoflurane + Aβ25-35 + trehalose group (Iso+Aβ+Tre group,treated with 2% isoflurane,10 μmol·L-1Aβ25-35 and 200 mmol·L-1trehalose),and trehalose group (Tre group,treated with 200 mmol·L-1trehalose).The survival rates of the PC12 cells were detected by MTT assay;the apoptotic rates of the PC12 cells in various groups were determined by Hoechst 33342 staining;the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) of the PC12 cells were measured by DCFH-DA fluorescence assay;the levels of malondialdehyd (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD),glutathion peroxidase (GSH-Px), and catalase (CAT) of the PC12 cells were detected by commercial kits.ResultsCompared with control group,the apoptotic rates of the cells were increased and the survival rates were decreased,and the levels of ROS and MDA and the activities of SOD,GSH-Px, and CAT in the PC12 cells were significantly decreased (P<0.05 orP<0.01) in Aβ group,Iso group and Iso+Aβ group.Compared with Iso group or Aβ group,the apoptotic rates were increased,the survival rates were decreased,the levels of ROS and MDA were increased,and the activities of SOD,GSH-Px,and CAT in the PC12 cells in Iso+Aβ group were decreased(P<0.05).Compared with Iso+Aβ group,the survival rates were increased and the apoptotic rates were decreased and the levels of ROS and MDA were decreased,and the activities of SOD,GSH-Px,and CAT in the PC12 cells in Iso+Aβ+Tre group were increased (P<0.05).ConclusionIsoflurane could aggravate the oxidative stress injury and the apoptosis induced by Aβ25-35 in the PC12 cells of the rats,and trehalose could alleviate the cytotoxicity of isoflurane via inhibition of oxidation and apoptosis.

isoflurane;Alzheimer’s disease;PC12 cells;oxidative stress;apoptosis;trehalose

1671-587Ⅹ(2015)02-0207-06

10.13481/j.1671-587x.20150201

2014-10-10

國家自然科學基金資助課題(81141065,81271215)

徐姍姍(1982-)，女，吉林省長春市人，在讀醫(yī)學碩士，主要從事全身麻醉藥物對阿爾茨海默病發(fā)病機制影響的研究。

馮春生，副教授，碩士研究生導師 (Tel：0431-88782955，E-mail：fcs1971@hotmail.com)

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網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-03-10 11:34

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