齊 玲，王瑋瑤，張艷春，蔡尚霞，楊寧江，劉曉麗

（1.吉林醫(yī)藥學院病理學教研室，吉林 吉林 132013；2.北華大學第二附屬醫(yī)院兒科，吉林 吉林 132021）

近年來哮喘的患病率和死亡率均呈上升趨勢，哮喘已成為嚴重威脅公眾健康的一種主要慢性疾病，尤其是兒童哮喘的發(fā)生給患兒及家屬帶來了沉重的負擔。研究［1－3］顯示：哮喘的發(fā)生與腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）有關聯(lián)，但研究結果僅限于對患者血清TNF－α水平的檢測，而半胱氨酸蛋白酶8（cysteine containing aspirate specific protease－8，Caspase－8）、受體相互作用蛋白（reportor interacting protein，RIP）、腫瘤壞死因子相關受體2（TNF receptor－associated factors－2，TRAF－2）和半胱氨酸蛋白酶3（cysteine containing aspirate－specific protease－3，Caspase－3）在兒童哮喘發(fā)病中的作用還未見相關報道。因此，本研究檢測不同哮喘發(fā)作狀態(tài)時患兒血清中TNF－α通路相關蛋白的表達變化，探討兒童哮喘的發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2011年1月—2012年1月在北華大學第二附屬醫(yī)院住院的33例哮喘患兒，年齡1～14歲，平均年齡（4.8±4.1）歲，其中男性18例，女性15例，患兒診斷均符合2008年中華醫(yī)學會修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》［4］。選擇31名正常門診體檢兒童作為對照組，其中男性14名，女性17名，年齡1～18歲，平均年齡（5.8±2.9）歲。本研究通過北華大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會的審核，所有研究對象均已簽署或由監(jiān)護人代為簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 TNF－α、Caspase－8抗體和二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色試劑（美國 Epitomics公司），TRAF－2和Caspase－3抗體（美國SANTA CRUZ公司），RIP抗體（美國BD公司）；J－26XP超低溫高速離心機（美國貝克曼公司），超低溫冰箱（MDF－U53V，日本三洋公司），PLUS 384全自動酶標儀（美國MDC公司）。

1.3 ELISA 法檢測 研究對象血清中TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白的表達水平［5］抽取對照組研究對象和哮喘患兒不同時期（急性發(fā)作期、臨床緩解期及慢性持續(xù)期）的外周靜脈血2mL，室溫靜置4h，將上清小心吸至

1.5 mL Eppendorf管中，做好標記后置入4℃冰箱中備用。待收集齊血清樣本，設空白對照，每個樣本3個復孔。取受試者血清，將血清與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入TNF－α、Caspase－8 、TRAF－2、RIP和Caspase－3 抗 體（1∶1000稀釋），于 4℃ 過夜。次日加入二抗（1∶1000稀釋）室溫下孵育2h，加顯色液室溫避光顯色。于自動酶標儀492nm處測定吸光度（A）值，用標準品繪制標準曲線后計算樣本濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。各組研究對象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達水平以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

各組研究對象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達水平ELISA結果顯示：各期哮喘患兒血清中TNF－α表達水平均升高。與對照組比較，哮喘患兒急性發(fā)作期血清中 TNF－α、Caspase－3和Caspase－8蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），臨床緩解期及慢性持續(xù)期血清中Caspase－8蛋白表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），臨床緩解期血清中Caspase－3蛋白表達水平降低（P＜0.05），而慢性持續(xù)期血清中Caspase－3蛋白表達水平升高（P＜0.05）。與對照組比較，哮喘患兒臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期血清中TRAF2及RIP蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

3 討 論

TNF－α是一種由活化的巨噬細胞所產生的細胞因子，其在炎癥反應和細胞免疫等多種病理過程中發(fā)揮著關鍵的作用。因此，有關TNF－α信號傳導通路的研究一直是生物醫(yī)學研究領域的熱點內容。TNF－α和TNF－β雖不同，但其DNA序列同源性可達56%，氨基酸水平同源性可達36%，而且兩者作用的受體均為腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）。TNFR 有TNFR1和TNFR2兩種形式，均為Ⅰ型跨膜糖蛋白，前者在體內的大多細胞表面均廣泛分布，后者僅局限在免疫細胞。當TNF－α與TNFR1結合后，與細胞中TNFR死亡域結合蛋白（TNFR－associated death domain protein，TRADD）結合，再與細胞中Fas相關死亡域蛋白（Fas－associated with death domain protein，F(xiàn)ADD）和Caspase－8結合，進而激活其下游Caspase－3蛋白，通過經(jīng)典的凋亡途徑使細胞發(fā)生凋亡［6－7］。另一方面，TNF－α與TNFR1相結合后，會募集TRAF2和RIP，進而激活NF－κB信號通路而發(fā)揮多重生理調控功能［8－10］。

表1 各組研究對象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

表1 各組研究對象血清中 TNF－α、Caspase－8、Caspase－3、TRAF－2和RIP蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of TNF－α，Caspase－8，Caspase－3，TRAF－2，and RIP proteins in serum of objects in various groups［，ρB／（μg·L－1）］

＊P＜0.05compared with control group.

ase－3 TRAF2 RIP Control 31 14.01±0.51 20.34±0.80 1.23±0.07 4.13±0.21 0.77±0.07 Asthma 33 Clinical remission 15.75±0.96 18.12±1.12 1.03±0.09＊ 2.76±0.08 0.71±0.08 Chronic persistent 17.33±0.51 16.11±1.02 1.36±0.21＊ 4.28±0.42 0.79±0.04 Acute exacerbation 19.86±0.76＊ 32.99±5.04＊ 1.40±0.20＊3.77±0.37 0.77±0.16 Group n TNF－α Caspase－8 Casp

國內外關于哮喘與TNF－α的關系已有大量臨床血清學檢測結果來支持，但具體TNF－α通路在哮喘發(fā)生機制中如何發(fā)揮作用尚不清楚［11－13］。本研究結果顯示：臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TNF－α表達水平均升高，尤其是急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TNF－α表達水平明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。這說明哮喘兒童血清TNF－α水平與哮喘的發(fā)生有密切關聯(lián)，與此前研究［1－3］結果一致。同時，哮喘患兒處于臨床緩解期和慢性持續(xù)期時，血清中TNF－α表達水平升高，提示TNF－α可能全程參與了兒童哮喘的發(fā)生發(fā)展。

急性發(fā)作期哮喘患兒血清中Caspase－8蛋白表達水平明顯升高，這一結果與TNF－α表達規(guī)律一致。說明哮喘急性發(fā)作可能通過激活TNF－α通路，活化細胞中的Caspase－8蛋白，使之表達增加，引起凋亡經(jīng)典途徑激活而引發(fā)細胞凋亡，促使哮喘發(fā)生。Caspase－3是凋亡傳導通路的下游凋亡執(zhí)行蛋白［14－15］，急性發(fā)作期患兒血清中 Caspase－3蛋白表達水平亦升高。這進一步驗證了哮喘急性發(fā)作時TNF－α通路激活，引起細胞中Caspase－8蛋白活化后繼而激活Caspase－3蛋白，使細胞凋亡發(fā)生，最終誘發(fā)哮喘。

本研究結果顯示：臨床緩解期、慢性持續(xù)期和急性發(fā)作期哮喘患兒血清中TRAF2和RIP蛋白表達水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。這說明TRAF2和RIP蛋白可能不參與TNF－α信號通路在哮喘中的作用。但由于本實驗患兒例數(shù)較少，不能完全排除該2種蛋白的作用。具體哪種細胞發(fā)生了凋亡，引起患兒哮喘發(fā)生尚未完全定論，也可能有其他的凋亡傳導通路在哮喘發(fā)生中起作用，但哮喘與TNF－α的關系還需更多的動物或細胞實驗來證實。

［1］Yang G，Chen J，Xu F，et al.Association between tumor necrosis factor－αpolymorphism and risk of asthma：a metaanalysis［J］.PLoS One，2014，9（6）：e99962.

［2］Nam HS，Lee SY，Kim SJ，et al.The soluble tumor necrosis factor－alpha receptor suppresses airway inflammation in a murine model of acute asthma［J］.Yonsei Med J，2009，509（4）：569－575.

［3］Brightling C，Berry M，Amrani Y.Targeting TNF－alpha：a novel therapeutic approach for asthma ［J］.J Allergy Clin Immunol，2008，121（1）：5－10.

［4］中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組，中華兒科雜志編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南 ［J］.中華兒科雜志，2008，46（10）：745－753.

［5］齊 玲，金 宏，趙東海，等.五味子木脂素誘導膠質瘤神經(jīng)球細胞凋亡的機制研究 ［J］.中國藥學雜志，2014，49（2）：113－116.

［6］Depuydt B，Van Loo G，Vandenabeele P，et al.Induction of apoptosis by TNF receptor 2in a T－cell hybridoma is FADD dependent and blocked by caspase－8inhibitors ［J］.J Cell Sci，2005，118（Pt 3）：497－504.

［7］Chattopadhyay A，Hood BL，Conrads TP，et al.Extrinsic apoptosis is impeded by direct binding of the APL fusion protein NPM－RAR to TRADD ［J］.Mol Cancer Res，2014，12（9）：1283－1291.

［8］Eum HA，Vallabhaneni R，Wang Y，et al.Characterization of DISC formation and TNFR1translocation to mitochondria in TNF－α－treated hepatocytes ［J］.Am J Pathol，2011，179（3）：1221－1229.

［9］Kesanakurti D，Chetty C，Bhoopathi P，et al.Suppression of MMP－2attenuates TNF－αinduced NF－κB activation and leads to JNK mediated cell death in glioma ［J］.PLoS One，2011，6（5）：e19341.

［10］Ruspi G，Schmidt EM，McCann F，et al.TNFR2increases the sensitivity of ligand－induced activation of the p38MAPK and NF－κB pathways and signals TRAF2protein degradation in macrophages［J］.Cell Signal，2014，26（4）：683－690.

［11］Fotin－Mleczek M，Henkler F，Samel D，et al.Apoptotic crosstalk of TNF receptors：TNF－R2－induces depletion of TRAF2and IAP proteins and accelerates TNF－R1－dependent activation of caspase－8 ［J］.J Cell Sci，2002，115（13）：2757－2770.

［12］Manthei DM，Schwantes EA，Mathur SK，et al.Nasal lavage VEGF and TNF－αlevels during a natural cold predict asthma exacerbations ［J］.Clin Exp Allergy，2014，8.doi：10.1111／cea.12387.

［13］Choi JP，Kim YM，Choi HI，et al.An important role of tumor necrosis factor receptor－2on natural killer T cells on the development of dsRNA－enhanced Th2cell response to inhaled allergens［J］.Allergy，2014，69（2）：186－198.

［14］鐘 越，齊 玲，沈 楠，等.越桔原花青素調控腦膠質瘤細胞生長的機制研究 ［J］.中國病理生理雜志，2014，30（4）：603－608.

［15］齊 玲，王 爽，溫 娜，等.白附子提取物對膠質瘤細胞的生長抑制作用及其機制 ［J］.吉林大學學報：醫(yī)學版，2014，49（4）：768－771.