王 川,賈志芳,曹東慧,武 興,曹雪源,姜 晶
(1.吉林大學第一醫(yī)院臨床流行病學研究中心,吉林 長春 130021;2.吉林大學第一醫(yī)院胃結(jié)直腸外科,吉林 長春 130021)
胃癌是我國常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率均位于第3位[1]。中國成年人中有50%以上感染幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp),但只有少數(shù)個體最終發(fā)展成胃癌,提示宿主遺傳因素在胃癌的易感性方面有重要作用[2]。隨著近年來胃癌分子遺傳學研究的深入,與基因轉(zhuǎn)錄過程相關(guān)酶的基因多態(tài)性研究得到了廣泛開展。DNA甲基化是常見的表觀遺傳修飾,由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)家族催化,包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b[3]。DNMT3b的主要功能是參與從頭甲基化,以非甲基化的DNA為模板,催化新的甲基化位點形成[4]。抑癌基因啟動子區(qū)CpG島如果呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài),則抑癌基因失活。國內(nèi)外研究[5]顯示:胃黏膜組織中異常表達的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,可能為癌癥發(fā)生的早期階段創(chuàng)造了條件。個體單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)差異可能使DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達水平不同,從而使得個體對腫瘤的易感性存在差異。已有研究[6-7]結(jié)果顯示:DNMT3b基因多態(tài)性與人類結(jié)直腸癌、肺癌等腫瘤易感性有關(guān)。目前國內(nèi)對DNMT3b基因多態(tài)性的研究多局限于啟動子區(qū)或單個SNPs位點。本研究選擇DNMT3b基因的5個SNPs位點,采用病例對照研究方法,探討DNMT3b基因多態(tài)性是否影響其蛋白表達水平及其與胃癌的關(guān)系,為胃癌的病因?qū)W研究提供依據(jù)。
1.1 研究對象 采用病例對照設(shè)計。病例組為2008—2010年本院收治的胃癌患者,共447例。病例組納入標準:來自吉林省長春市,中國北方漢族人,年齡30~90歲,在本院胃結(jié)直腸外科行手術(shù)治療,并經(jīng)病理報告明確診斷為非賁門部胃癌;其中男性322例,女性125例,年齡35~90歲,平均年齡(61.70±11.09)歲。對照組為同時期在本院體檢中心體檢的健康對照者,共961名,其中男性564名,女性397名,年齡35~79歲,平均年齡(50.40±8.51)歲。對照組納入標準:血清Hp-IgG檢測陰性(<30EIU),無萎縮性胃炎和惡性腫瘤史,常規(guī)體檢結(jié)果均正常,按年齡、性別頻數(shù)匹配挑選。排除標準:年齡小于30歲或大于90歲者,非中國漢族北方人群,并發(fā)其他嚴重疾病可能會影響到胃癌病情進展者。所有受試者均知情同意,研究方案經(jīng)本院倫理委員會批準。
1.2 主要試劑和儀器 HpIgG抗體(Biohit公司,芬蘭),全血基因組DNA提取試劑盒(Axygen公司,美國);Multiskan GO1510全波長酶標儀(Thermo Fisher Scientifc公司,美國),S1000TM熱循環(huán)儀(Bio-Rad公司,美國)?;蚍中蜋z測由美國Applied Biosystems公司完成。
1.3 Hp感染檢測和基因組DNA提取 采集所有研究對象外周血500μL并冷凍保存(EDTA K2抗凝,-80℃)。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測所有研究對象血清中HpIgG抗體(Biohit公司,芬蘭),使用Multiskan GO 1510全波長酶標儀檢測450nm波長處的吸光度(A)值,計算樣本的酶免疫單位(EIU)數(shù)值,結(jié)果≥30EIU判定為陽性。使用Axyprep血基因組DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA,按照說明書進行操作。
1.4 SNPs位點的選擇和分型 使用SNP browser軟件篩選HapMap數(shù)據(jù)庫中國漢族人群DNMT3b基因的標簽SNP位點,要求最小等位基因頻率(MAF)>0.10,同時r2>0.8。共22個SNPs位點滿足 MAF>0.10,其中18個SNPs顯示與標簽SNPs的完全連鎖不平衡(D′=1,r2>0.8),最終選擇了rs6119954、rs4911107、rs4911259和rs8118663共4個標簽SNPs位點以及基因啟動子區(qū)rs1569686位點進行測定,采用TaqMan技術(shù)確定每個SNPs位點的基因分型。BIO-RAD S1000TM熱循環(huán)儀設(shè)置的擴增程序:95°C、10min,95°C、15s,60°C、1min,共40個循環(huán)。
1.5 免疫組織化學法檢測胃癌組織和癌旁組織中DNMT3b多態(tài)性與基因表達的關(guān)系 采用鏈霉素-生物素-過氧化物酶法對104例胃癌患者的胃癌組織和85例患者的癌旁對照組織進行了免疫組織化學染色,由2名獨立的病理學家進行評分。采用HSCORE評分系統(tǒng)評估染色強度及特定強度范圍內(nèi)細胞染色的百分比:HSCORE=∑Pi(i)(i=0,1,2,3,Pi=0~100%)。i代表腫瘤細胞的染色強度(無染色=0,弱染色=1,中度染色=2,強染色=3),Pi是每一個強度下腫瘤細胞染色的百分比,范圍0~100%。HSCORE總分為各強度得分之和,結(jié)果為0~300,依據(jù)表達水平的高低分為高表達(HSCORE>200)、中度表達(100<HSCORE<200)、低表達(HSCORE≤100)和陰性(HSCORE=0),結(jié)果以中位數(shù)(四分位數(shù))表示。
1.6 統(tǒng)計學分析 采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗分析對照組研究對象的基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡。病例組和對照組研究對象的基因型及其他指標的分布情況比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法。調(diào)整性別、年齡和Hp感染的作用后,采用非條件Logistic回歸分析計算基因型與胃癌危險性的OR值及95%可信區(qū)間(CI)。DNMT3b基因多態(tài)性與表達水平的關(guān)聯(lián)分析采用Mann-Whitney U 檢驗或Kruskal-Wallis H 檢驗。
2.1 研究對象的一般特征 與對照組比較,病例組患者的年齡大,男性所占比例高,故后續(xù)的統(tǒng)計分析均調(diào)整了年齡和性別因素的影響;病例組患者中Hp抗體陽性率明顯高于對照組(69.1%vs 49.7%,P<0.001);病理分期方面,病例組進展期胃癌患者居多,Ⅱ、Ⅲ期共占72.7%;分化程度方面,低分化者占62.9%;Lauren分型顯示病例組腸型胃癌為主要病理類型,占68.2%。2組研究對象的一般特征見表1。
2.2 DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌的關(guān)聯(lián)性 對照組研究對象DNMT3b的5個SNPs位點rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均進行了 Hardy-Weinberg平衡檢驗,其P 值分別為 0.036、0.321、0.341、0.362和0.874。rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均符合Hardy-Weinberg平衡,但rs6119954偏離了Hardy-Weinberg平衡,隨機挑選了100例研究者進行了實驗驗證,結(jié)果相同,故仍將該位點納入分析。調(diào)整年齡、性別和Hp感染等因素,利用非條件Logistic回歸分析DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌的關(guān)聯(lián)結(jié)果表明:與攜帶GG基因型比較,攜帶rs6119954AA基因型的個體發(fā)生胃癌的危險性是其1.25倍(95%CI:0.86~2.10,P=0.19)。在其他4個SNPs位點上,同樣均未發(fā)現(xiàn)DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生有關(guān)聯(lián)。見表2。
表1 研究對象的一般特征Tab.1 General characteristics of subjects[n(η/%)]
2.3 DNMT3b基因多態(tài)性和胃癌組織中DNMT3b蛋白表達水平的關(guān)系 免疫組織化學染色結(jié)果顯示:多數(shù)患者DNMT3b蛋白在胃癌組織的細胞核中呈高表達,僅在少數(shù)患者胃癌組織的細胞質(zhì)中呈弱表達。在胃癌組織中DNMT3b的HSCORE為180(140~240),癌旁對照組織中DNMT3b的HSCORE為90(0~240),胃癌組織中DNMT3b的表達水平顯著高于癌旁對照組織(P<0.001)。DNMT3b基因的5個SNPs的不同基因型間DNMT3b蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。
DNA異常甲基化導致的抑癌基因失活在腫瘤早期發(fā)生過程中起重要作用[8-9]。既往對DNMT3b基因多態(tài)性的研究[10]中,大都局限于啟動子區(qū)單個轉(zhuǎn)錄起始位點(如-149C→T),本研究通過SNPs數(shù)據(jù)庫篩選,挑選出覆蓋DNMT3b基因的4個標簽SNPs,還添加了1個位于啟動子區(qū)域的SNP,更全面地分析了DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌之間的關(guān)系。
表2 病例組和對照組DNMT3b基因型頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic frequencies of DNMT3bin case and control groups
表3 DNMT3b基因多態(tài)性與胃癌組織中DNMT3b蛋白表達水平的關(guān)系Tab.3 Relationship between DNMT3bgene polymorphisms and expression level of DNMT3bprotein in gastric cancer tissue
Hu等[11]研究發(fā)現(xiàn):啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點上游-579G>T位點(rs1569686)的基因多態(tài)性與胃癌的易感性相關(guān),與對照組比較,攜帶G等位基因的個體患胃癌的易感性顯著降低。本研究雖然在更大規(guī)模的中國人群中進行驗證,卻未發(fā)現(xiàn)rs1569686基因多態(tài)與胃癌的易感性有關(guān)聯(lián)。有研究[12-13]顯示:DNMT3b基因啟動子區(qū)-149位的SNP(rs2424913)T等位基因變異可以使轉(zhuǎn)錄活性增加30%,使DNMT3bmRNA和蛋白表達水平升高,T等位基因攜帶者患肺癌風險幾乎是CC型的2倍,而乳腺組織中攜帶C等位基因者更易罹患乳腺癌,因此研究者們也關(guān)注了rs2424913位點與胃癌發(fā)生的關(guān)系[10-11,14]。Aung等[15]對日本人群進行了研究,在病例組與對照組中未發(fā)現(xiàn)等位基因頻率分布的差異,這與 Wang等[10]和Hu等[11]對中國人群的研究結(jié)論一致。不同研究結(jié)果的差異可能是由于SNPs的罕見基因型頻率在不同種族間分布差異引起的,中國漢族人群和日本人群rs2424913位點的C等位基因頻率分別為1.2%和0.6%,而美國白人C等位基因的頻率為59.7%(HapMap數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果),因此以中國漢族人群和日本人群為對象的研究其檢驗效能不足,難以發(fā)現(xiàn)rs2424913和胃癌之間的關(guān)聯(lián)。由于本研究中病例組人數(shù)僅為447人,漢族人群中C等位基因的頻率也僅為1.2%,其檢驗效能遠低于0.8,因此本研究未納入該位點。Yang等[14]在中國南方人群中對DNMT3b的rs2424908SNP進行了研究,但未發(fā)現(xiàn)rs2424908SNP與胃癌發(fā)生有關(guān)聯(lián),由于rs2424908和rs8118663有完全的連鎖不平衡(D′=1,r2=1),本研究則選擇rs8118663進行研究,同樣未發(fā)現(xiàn)其基因變異與胃癌發(fā)生有關(guān)聯(lián)。本研究所選取的胃癌患者均為非賁門癌,而在Yang等[14]的研究中包括了賁門癌和非賁門癌的患者,目前公認這2種組織類型的胃癌在病因、生存和預(yù)后方面存在明顯差異,因此病例的抽樣是否導致結(jié)論發(fā)生偏倚還需要更大規(guī)模研究的驗證。
蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物,其功能是參與維持DNA甲基化狀態(tài),本文作者推測腫瘤組織中如能檢出DNMT3b蛋白的高表達,可能提示DNMT3b參與了腫瘤的形成。Su等[16-17]研究發(fā)現(xiàn):DNMT3b主要在原發(fā)性胃腫瘤中過表達,這種表達水平上的差異與臨床病理學有關(guān)聯(lián),同時Hp感染可能導致DNMT3b高表達。本課題組雖然發(fā)現(xiàn)了胃癌患者腫瘤組織中DNMT3b蛋白高表達,但未發(fā)現(xiàn)胃癌患者中攜帶不同基因型的個體腫瘤組織中DNMT3b表達的差異。因此腫瘤組織中DNMT3b高表達可能來源于表觀遺傳學改變和蛋白翻譯后修飾,而與基因多態(tài)性無關(guān)聯(lián)。
綜上所述,DNMT3b基因的rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663位點的SNPs與胃癌的發(fā)病風險無關(guān)聯(lián),并且該基因多態(tài)性與DNMT3b蛋白表達水平也無關(guān)聯(lián),提示DNMT3b基因多態(tài)性在中國北方漢族人群中尚不能作為預(yù)測個體對胃癌易感性的遺傳標記。
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