王杰華，李國(guó)前，楊小霞，洪諸權(quán)

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 泉州 362000）

腦缺血性損傷后機(jī)體組織中有一個(gè)復(fù)雜的、多基因作用的神經(jīng)保護(hù)網(wǎng)絡(luò)，其中胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin－like growth factor 1，IGF－1）在該網(wǎng)絡(luò)中起重要作用［1－2］。IGF－1作為一種特異性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，可維持神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制其凋亡，并有助于神經(jīng)細(xì)胞受損后的功能恢復(fù)［3］。尤瑞克林可以減少腦缺血損傷面積，減輕神經(jīng)功能損傷［4］，但其具體作用機(jī)制尚未明確。本研究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，給予尤瑞克林進(jìn)行干預(yù)，探討尤瑞克林對(duì)IGF－1和胰島素樣生長(zhǎng)因子1受 體（insulin－like growth factor 1receptor，IGF－1R）表達(dá)的影響和意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量250～300g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（使用許可證號(hào)：SCXK閩20042002）。注射用尤瑞克林（0.15PNAU／瓶，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒（立陶宛 MBI Fermentas公司）；兔抗大鼠IGF－1和IGF－1R抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；即用型免疫組織化學(xué)試劑盒（鼠／兔，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；β－actin和辣根酶標(biāo)記IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Beyo ECL和Western熒光檢測(cè)試劑（中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司）；引物合成由上海生物工程有限公司完成。

1.2 動(dòng)物分組及給藥 24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組8只。模型組和實(shí)驗(yàn)組參考改良Longa線栓法［5］制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型。血流阻斷2h后拔出線栓，形成再灌注。

假手術(shù)組大鼠接受相似手術(shù)處理，但是不插入線栓。實(shí)驗(yàn)組大鼠于再灌注后5min靜脈注射尤端克林（用滅菌生理氯化鈉溶液稀釋至3.5×10－3PNAU·kg－1），劑量為1mL·kg－1。假手術(shù)組和模型組大鼠正常喂養(yǎng)。

1.3 模型處理和取材部位 大鼠再灌注48h后，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰臥固定，迅速開胸暴露心臟。經(jīng)左心室行主動(dòng)脈插管，剪開右心耳作為灌注液流出口，在10～20min內(nèi)經(jīng)左心室灌注200mL生理鹽水快速?zèng)_洗，取出全腦，濾紙吸去表面水分，去除嗅球、小腦和腦干。冰盤上迅速分離大腦半球，棄去左側(cè)大腦半球，取右側(cè)半球，取大鼠視交叉后6～11mm處的腦組織備用。

1.4 RT－PCR 法 檢 測(cè) 大 鼠 腦組織 中 IGF－1和IGF－1RmRNA的表達(dá) IGF－1上游引物序列：5′－TGCAAAGGAGAAGGAAAGGAAG－3′，下游引物序列：5′－TCAGCAGCCAAAATTCAGAGAG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為499bp；IGF－1R上游引物序列：5′－AAACGCTGACCTCTGTTACCTCTC－3′，下游引物序列：5′－GCGGATGAAGCCTGATGGAC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為505bp；內(nèi)參β－actin上游引物序列：5′－ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT－3′，下游引物序列：5′－AGCTGTGGTGGTGAAGCTGTAG－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為269bp。取缺血側(cè)腦組織按Trizol法提取總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃、30s，64℃、30s，72℃、30s，共34個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完畢后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，半定量分析電泳條帶的吸光度（A）值，結(jié)果以目的基因與β－actin A值的比值表示。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R的表達(dá)水平 大鼠腦組織切片經(jīng)脫蠟至水，30mL·L－1H2O2室溫孵育5～10min，高壓修復(fù)2～5min；加入一抗兔抗大鼠IGF－1和IGF－1R抗體（工作濃度約為1∶100），4℃濕盒孵育過夜；再加入滴加生物素化小鼠抗兔的二抗，室溫30min，AEC顯色10～20min（顯微鏡下控制顯色程度）；自來水充分沖洗，終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染；滴加水性封片劑，干燥后中性樹膠封片。各步驟間用0.01mol·L－1PBS沖洗5min×3次，以陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)表示IGF－1和IGF－1R的表達(dá)水平。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在400倍光學(xué)顯微鏡下分別隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)免疫反應(yīng)陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western blotting法檢測(cè)大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白的表達(dá)水平 取大鼠缺血側(cè)腦組織100mg置于玻璃勻漿器中，加入裂解液，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行蛋白提取，然后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取25μg蛋白，變性后垂直電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含10%脫脂奶粉的TBS室溫封閉2h，分別加入一抗（兔抗大鼠IGF－1和IGF－1R抗 體，1∶500；兔抗大鼠β－actin 抗體，1∶1500），4℃ 孵育過夜，用含0.1%Tween－20 的TBS洗滌3次，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2000）室溫孵育1h，重復(fù)洗滌3次，最后用ECL液顯色，X片顯影、定影。采用Image J圖像分析測(cè)定Western blotting條帶的灰度值，結(jié)果以IGF－1、IGF－1R與β－actin灰度值的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R mRNA和蛋白表達(dá)水平、IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞數(shù)以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達(dá)水平 假手術(shù)組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA呈低水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組和模型組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達(dá)水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of IGF－1and IGF－1RmRNA in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

表1 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of IGF－1and IGF－1RmRNA in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

＊P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

IGF－1mRNA IGF－1RmRNA Sham op Group eration 0.179±0.038 0.257±0.045 Model 0.320±0.054＊ 0.453±0.064＊Experiment 0.425±0.062＊△ 0.537±0.066＊△

2.2 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞數(shù) IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞胞漿染色呈淺紅色或紅色。假手術(shù)組大鼠腦組織切片中見少量散在IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組和模型組大鼠腦組織切片中IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織切片中IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞數(shù)高于模型組（P＜0.05）。見表2和圖2（插頁六）。

圖1 各組大鼠腦組織中IGF－1（A）和IGF－1R（B）mRNA表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of IGF－1（A）and IGF－1R（B）mRNA in brain tissue of rats in various groups

表2 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of IGF－1and IGF－1Rpositive cells in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

表2 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R陽性細(xì)胞數(shù)Tab.2 Number of IGF－1and IGF－1Rpositive cells in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

＊P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

ositive cells Sham op Group No.of IGF－1 positive cells No.of IGF－1R p eration 13.24±2.94 12.52±3.45 Model 29.10±5.78＊ 34.54±6.35＊Experiment 41.28±8.52＊△ 56.41±9.28＊△

2.3 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達(dá)水平 假手術(shù)組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白呈低水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組和模型組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達(dá)水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達(dá)水平高于模型組（P＜0.05）。見表3和圖3。

表3 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of IGF－1and IGF－1Rproteins in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

表3 各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1R蛋白表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of IGF－1and IGF－1Rproteins in brain tissue of rats in various groups （n＝8，）

＊P＜0.05 vs sham operation group；△P＜0.05 vs model group.

rotein Sham op Group IGF－1protein IGF－1Rp eration 0.17±0.03 0.12±0.04 Model 0.35±0.05＊ 0.54±0.06＊Experiment 0.71±0.09＊△ 0.68±0.08＊△

圖3 各組大鼠腦組織中IGF－1（A）和IGF－1R（B）蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of IGF－1（A）and IGF－1R（B）proteins in brain tissue of rats in various groups

3 討 論

IGF－1是一種活性蛋白多肽物質(zhì)，幾乎可作用于所有的組織細(xì)胞［6］，其與受體IGF－1R結(jié)合后啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化，有效地抑制細(xì)胞程序性死亡。IGF－1系大腦發(fā)育所必需，在正常腦組織的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用；IGF－1與IGF－1R的結(jié)合可防止神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增加血管發(fā)生和神經(jīng)發(fā)生等多種途徑減輕缺氧缺血對(duì)腦組織的損害［7－10］。IGF－1與IGF－1在正常腦組織有少量表達(dá)，而腦缺血損傷發(fā)生后，腦組織中IGF－1與IGF－1R表達(dá)水平即明顯增加［11］。本研究采用線栓法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，采用RT－PCR、免疫組織化學(xué)法和Western blotting法檢測(cè)大鼠缺血區(qū)腦組織中IGF－1和IGF－1R表達(dá)的結(jié)果顯示：在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA及蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血區(qū)腦組織中IGF－1和IGF－1RmRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高，提示缺血性損傷應(yīng)激可促進(jìn)腦組織中IGF－1和IGF－1R的生成。

注射用尤瑞克林（人尿激肽原酶）是從人尿液中提取精制的糖蛋白，有效成分為人尿激肽原酶，是激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)的一個(gè)正向調(diào)節(jié)物質(zhì)。腦組織缺血損傷后整個(gè)激肽釋放酶－激肽系統(tǒng)，包括激肽原酶、激肽均會(huì)一過性地升高，激肽受體表達(dá)也上調(diào)，表明激肽原酶－激肽系統(tǒng)參與腦缺血病理生理過程［12］。注射用尤瑞克林除了可以通過激肽途徑選擇性擴(kuò)張缺血區(qū)域腦血管，增加局部血液灌注而發(fā)揮作用外，還可以抑制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡過程，減少局部炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的分化、遷移和成熟，增加局部血管的再生，促進(jìn)側(cè)支血管的建立和開放［13－14］。動(dòng)物腦缺血模型研究［15］表明：靜脈注射尤瑞克林對(duì)腦梗死、腦缺血再灌注損傷和急性腦缺血再灌注損傷恢復(fù)期動(dòng)物均有改善作用，能顯著縮小腦梗死面積，改善神經(jīng)癥狀并減少腦組織含水量。本實(shí)驗(yàn)在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用尤瑞克林進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組大鼠缺血區(qū)腦組織中IGF－1和IGF－1R的mRNA和蛋白的表達(dá)高于模型組，提示尤瑞克林可進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)源性IGF－1和IGF－1R的合成與表達(dá)。IGF－1和IGF－1R的表達(dá)上調(diào)，可調(diào)控下游信號(hào)通路，從而減輕缺血性腦損傷病情的發(fā)展，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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