楊 易，祁愛琴，郝秀靜，徐金瑞

（寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

我國糖尿病患者人數(shù)近1億，其中2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）患者約占95%。遺傳因素與環(huán)境因素共同決定了T2DM的發(fā)生［1－2］。T2DM的主要病理生理改變是胰島素的分泌缺陷和胰島素抵抗［3］，因此與胰島素分泌、胰島素信號傳導通路和胰島β細胞凋亡相關的基因是T2DM發(fā)病機制研究的重要候選基因。全基因組關聯(lián)研究（genome－wide association study，GWAS）顯示：轉錄因子7類似物2（transcription factor 7like 2，TCF7L2）基因異常表達與T2DM 的發(fā)生有關聯(lián)［4－6］。TCF7L2基因又稱T細胞轉錄因子4（T cell factor－4，TCF4），位于人類染色體10q25.3，長度為215.9kb，包括14個外顯子。其表達產物是Wnt信號傳導通路的關鍵因子，對胰島β細胞功能有調控作用。TCF7L2基因發(fā)生變異最終導致β細胞功能缺陷，胰島素分泌不足［7］。TCF7L2基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs） 與T2DM的發(fā)生有一定關聯(lián)性，但對不同種族或人群的研究結果存在差異性［8－10］。rs290487位點位于TCF7L2基因7號內含子上，在10號染色體上位置為114909731。目前在該位點上的研究沒有其他位點廣泛，且得出的結論亦不一致［11］。目前，尚未見TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性與寧夏回族人群T2DM關聯(lián)性研究的相關報道。本研究采用聚合酶鏈式反應－限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分型方法，對寧夏回族健康個體和T2DM患者TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性進行檢測，并通過遺傳統(tǒng)計分析，旨在揭示該位點多態(tài)性與T2DM的關聯(lián)性，以期為寧夏回族人群T2DM的早期預防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所用血樣來源于2011年寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院和寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院住院患者及體檢者，其中健康者109名（對照組），T2DM患者111例（T2DM組），年齡30～80歲。個體間均無血緣關系，且3代均為回族，在寧夏回族自治區(qū)居住3代以上。根據(jù)知情同意的原則，采研究對象的外周靜脈血樣本用于提取基因組DNA。T2DM納入標準參照1999年WHO的T2DM診斷標準和1999年10月我國糖尿病學會的中國人群T2DM診斷標準，并排除1型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他特殊類型的糖尿病。

1.2 基因組DNA提取 采用常規(guī)酚／氯仿提取法提取基因組DNA。

1.3 引物設計 根據(jù)GenBank中TCF7L2基因序列設計引物，擴增rs290487位點所在目的片段，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列：F，5′－AGGAGGCTGCCATATTGTTTACTT－3′；R，5′－ACACCTTTCTCATTTTCAATTTCGC－3′，擴增片段長度為153bp。

1.4 PCR反應 反應體系20μL，其中DNA模板（40mg·L－1）1.0μL，上下游引物各0.5μL，2 × Reaction Mix 9.5 μL，Golden DNA Polymerase（2.5U·μL－1）0.5μL，滅菌三蒸水8.0μL。PCR反應條件：94°C預變性5min；94°C變性30s，61℃退火30s，72°C延伸1min，30個循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。擴增完成后，取PCR產物3μL，采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 酶切反應 在20μL酶切體系中，加入PCR產物6μL，10×酶切緩沖液2μL，限制性內切酶（10U·μL－1）0.5μL，滅菌三蒸水 11.5μL。37℃水浴酶切6h后，采用3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。

1.6 基因型分析 根據(jù)酶切產物判斷個體基因型，3種基因型對應的酶切產物分別為TT：153bp；CT：153bp、128bp和25bp；CC：128bp和25bp。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。對照組與T2DM組研究對象的基因型和等位基因頻數(shù)分布分析采用Hardy－Weinberg平衡檢驗，組間比較采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1 PCR反應結果 擴增出的片段大小與預期大小一致，長度為153bp，且條帶清晰，可用于后續(xù)酶切反應。見圖1。

圖1 rs290487位點PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR products of rs290487site

2.2 PCR產物酶切反應結果 在對照組和T2DM組中均檢出3種基因型，分別為TT、CT和CC。見圖2。

圖2 rs290487位點PCR產物AccⅡ酶切電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR products of rs290487site digested by AccⅡenzyme

2.3 2組研究對象基因型和等位基因頻數(shù)分布在對照組和T 2DM組研究對象中基因型頻數(shù)分布符合 Hardy－Weinberg平衡定律（χ2＝4.021，P＞0.05；χ2＝1.581，P＞0.05），具有群體代表性。見表1。

表1 2組研究對象rs290487位點基因型頻數(shù)分布的Hardy－Weinberg平衡性檢驗Tab.1 Hardy－Weinberg equilibrium test for genotypic frequency distribution at rs290487site of TCF7L2gene

T2DM組和對照組研究對象基因型、等位基因頻數(shù)頻數(shù)分布：rs290487位點3種基因型TT、CT和CC在對照組研究對象中的頻數(shù)分別為31.19%、40.37%和28.44%，在T2DM組的頻數(shù)分別為24.32%、55.86%和19.82%，基因型頻數(shù)分布組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝5.370，P＞0.05）；等位基因T和C在對照組中的頻數(shù)分別為51.38%和48.62%，在T2DM組的頻數(shù)分別為52.25%和47.75%，等位基因型頻數(shù)分布組間比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.034，P＞0.05）。見表2。

表2 2組研究對象rs290487位點基因型和等位基因頻數(shù)分布Tab.2 Distribution of genotypic and allelic frequencies at rs290487site of objects in two groups ［n（η／%）］

3 討 論

SNPs是基因組變異中最常見的一種形式，在人類基因組中大概每1000個堿基中就有1個SNP。不同人之所以對疾病的易感程度有所區(qū)別，對藥物會產生不同反應，部分受到SNP影響。SNP作為第3代遺傳標記，在復雜疾病的基因定位、關聯(lián)分析、個體疾病易感性分析和藥物基因組學的研究中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。

國內外學者對不同人種TCF7L2基因SNPs位點與T2DM發(fā)生的關聯(lián)性的研究結果表明：T2DM本身具有高度遺傳異質性，不同地區(qū)和不同種族人群的遺傳背景不同，且生活習慣、環(huán)境因素等方面也有很大差異。TCF7L2基因變異型增加T2DM的發(fā)病風險的原因：在胰島β細胞中過表達，Wnt信號通路異常，導致前胰島素加工障礙，胰島素分泌減少，腸促胰島素的水平下降，肝糖原輸出水平增加，以及胰島淀粉樣蛋白沉積，影響胰島β細胞功能，并使胰島凋亡增加。

本研究采用PCR－RFLP法對寧夏回族健康個體和T2DM患者外周血中TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性進行檢測，結果表明：TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性與寧夏回族人群T2DM的發(fā)生無關聯(lián)。目前已有國內學者對不同地區(qū)人群TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性與T2DM的關聯(lián)性進行了研究。Chang等［12］對中國臺灣漢族人群、Ren等［13］對中國漢族人群、邊澈等［14］對中國沈陽地區(qū)漢族人群的研究結果均表明：TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性與T2DM的發(fā)生有關聯(lián)。而張勇等［1］對中國濟南地區(qū)人群、紀紅梅等［15］對中國遼寧地區(qū)人群、鄒云蓮等［16］對中國昆明地區(qū)漢族人群的研究結果均表明：TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性與T2DM的發(fā)生無關聯(lián)。任倩等［17］對中國臺灣、安徽和黑龍江省3個地區(qū)人群的多態(tài)性研究進行薈萃分析，合計樣本量，使用隨機效應模型選取T2DM患者9422例，正常人8585名，結果未發(fā)現(xiàn)rs290487位點多態(tài)性與T2DM發(fā)生有關聯(lián)。

綜上所述，TCF7L2基因與T2DM發(fā)生的關聯(lián)性研究結果在我國呈現(xiàn)出較強的異質性。本研究中TCF7L2基因rs290487位點多態(tài)性與寧夏回族人群T2DM發(fā)生未表現(xiàn)出關聯(lián)性，這是否因樣本量原因所致，還有待進一步擴大樣本量、充實實驗指標和實驗數(shù)據(jù)進行驗證。

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