陳剛毅，溫淑婷，林　育，李雯晴，李銘舜，王俊月，溫惠紅，寧偉杰

生物節(jié)律紊亂影響糖尿病腎病大鼠“氣陰虧虛”病機(jī)的初步探討*

陳剛毅1，溫淑婷2，林育2，李雯晴2，李銘舜2，王俊月3，溫惠紅2，寧偉杰2

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510405；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510405）

［目的］探討生物節(jié)律紊亂對(duì)糖尿病腎病大鼠“氣陰虧虛”病機(jī)的影響。［方法］選用健康SD雄性大鼠64只，隨機(jī)分為4組，每組16只，分別為:空白組、生物節(jié)律紊亂組、糖尿病腎?。―N）組、DN生物節(jié)律紊亂組。DN組及DN生物節(jié)律紊亂組為小劑量多次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液，高脂飼料喂養(yǎng)建立。復(fù)制大鼠糖尿病腎病模型后，生物節(jié)律紊亂組、DN生物節(jié)律紊亂組同時(shí)改變光照誘導(dǎo)為生物節(jié)律紊亂模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，觀察大鼠飲水量、尿量及體質(zhì)量變化情況，檢測(cè)大鼠模型血液中的血糖值、24 h尿蛋白定量及環(huán)磷酸腺苷（cAMP）與環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）的表達(dá)水平與比值；大鼠腎臟病理切片蘇木精-伊紅（HE）染色、過碘酸雪夫（PAS）染色觀察病理改變。［結(jié)果］1）與空白組相比，DN組與DN生物節(jié)律紊亂組的飲水量、尿量、血糖值、24 h尿蛋白定量明顯增多（P＜0.01）；DN組cAMP含量降低（P＜0.05），DN生物節(jié)律紊亂組cGMP含量升高（P＜0.05），cAMP/cGMP比值降低（P＜0.01）。2）與DN組相比，DN生物節(jié)律紊亂組飲水量、尿量、血糖值明顯下降（P＜0.01），24 h尿蛋白定量明顯增多（P＜0.01），腎臟病理?yè)p害嚴(yán)重；cGMP的含量升高，cAMP與cGMP的比值降低（P＜0.05）。［結(jié)論］生物節(jié)律紊亂可通過對(duì)機(jī)體耗氣傷陰，促進(jìn)糖尿病腎病進(jìn)程。

生物節(jié)律紊亂；糖尿病腎病；cAMP/cGMP；氣陰虧虛；病機(jī)探討

糖尿病腎病（DN）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，并由此導(dǎo)致終末期腎臟病，目前，中國(guó)DN發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題［1］。在臨床中觀察到，DN的證候演變有一定規(guī)律。早期以陰虛燥熱為主，中期發(fā)展為氣陰兩虛，而晚期則以陰陽(yáng)兩虛為主［2］。其中，氣陰兩虛是影響DN的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的重要階段。針對(duì)此階段進(jìn)行深入的探究有望揭示DN進(jìn)展的機(jī)制［3-4］。人類歷史正處于工業(yè)化進(jìn)程的加速期，隨著當(dāng)今社會(huì)壓力的增加，人們長(zhǎng)期處于熬夜、睡眠不足、晝夜顛倒等不良生活方式，進(jìn)而打亂人體正常的節(jié)律，加速疾病進(jìn)程［5］。本研究通過觀察生物節(jié)律紊亂對(duì)DN大鼠氣陰虧虛的分子環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）表達(dá)水平的影響，初步探討生物節(jié)律紊亂促進(jìn)DN的病機(jī)變化。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk（粵）2013-0092。

1.2主要試劑與儀器鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；大鼠cAMP、cGMP酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒（美國(guó)R&D公司）；羅氏血糖儀（瑞士羅氏公司）；全自動(dòng)生化分析儀（日立7170）；離心機(jī)Centrifuge5424（德國(guó)eppendorf公司）；酶標(biāo)儀MAX 190（美國(guó)SPECTRA公司）。

1.3動(dòng)物的選擇與分組選用健康SD雄性大鼠64只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組16只，分別為：空白組、生物節(jié)律紊亂組、DN組、DN生物節(jié)律紊亂組，分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.4糖尿病腎病大鼠的造模DN組及DN生物節(jié)律紊亂組采用小劑量多次腹腔注射40 mg/kg的STZ溶液（STZ溶于pH=4.3的0.1 mmol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液），配合高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制糖尿病腎病模型［6］，以連續(xù)3次檢測(cè)血糖＞16.6 mmol/L，24 h尿蛋白排泄＞30 mg為模型復(fù)制成功，整個(gè)造模周期為8周。

1.5干預(yù)措施復(fù)制DN大鼠模型后，即實(shí)驗(yàn)第9周開始，生物節(jié)律紊亂組、DN生物節(jié)律紊亂組同時(shí)改變光照時(shí)間。將兩組大鼠置于持續(xù)黑暗/持續(xù)光照各1周的條件下，經(jīng)歷3次環(huán)境顛倒循環(huán)共6周。空白組和DN組任置于正常12 h光照/12 h黑暗（光照08∶00～20∶00，黑暗20∶00～08∶00）條件下。

1.6標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)各組動(dòng)物分別在第1周（實(shí)驗(yàn)前）和第14周（實(shí)驗(yàn)后）安置于代謝籠中收集24 h尿液，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24 h尿蛋白排泄量，同時(shí)檢測(cè)大鼠血液中的血糖值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組大鼠用水合氯醛溶液（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉后，采用大鼠心臟取血法采集血液，EDTA促凝管收集，以3 000 r/min離心5 min，分離血漿。cAMP和cGMP的含量檢測(cè)采用ELISA法，顯色后用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定光密度（A）值，零孔設(shè)為對(duì)照，據(jù)各孔A值計(jì)算待測(cè)值的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)切取大鼠腎臟，去掉被膜，用冷生理鹽水灌洗以除去腎臟血管內(nèi)血液，固定于4%多聚甲醛，取少量腎組織常規(guī)制片，蘇木精-伊紅染色法（HE）及過碘酸雪夫（PAS）染色，光鏡放大200倍觀察腎組織病理變化。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)自身前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。組間比較時(shí)，若符合偏態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般狀況空白組小鼠反應(yīng)正常靈敏，體毛平伏有光澤；生物節(jié)律紊亂組小鼠反應(yīng)較不靈敏，體毛枯萎。DN組在模型成功后出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，活動(dòng)遲緩，體毛稀疏無(wú)光澤；DN生物節(jié)律紊亂組在成模后亦同時(shí)出現(xiàn)多飲多尿癥狀，相比于DN組，伴有飲食及尿量的減少，精神異常萎靡，活動(dòng)明顯遲緩，體毛枯萎無(wú)光澤，便溏。

去除造模失敗和數(shù)據(jù)不全大鼠后的數(shù)據(jù)顯示，DN組及DN生物節(jié)律紊亂組的大鼠的飲水量、尿量較空白組增加，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，變化值較空白組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)，DN生物節(jié)律紊亂組的飲水量、尿量較DN組減少，體質(zhì)量呈負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2各組大鼠不同時(shí)間段血糖測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)后的DN組及DN生物節(jié)律紊亂組的血糖值均較實(shí)驗(yàn)前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)，DN生物節(jié)律紊亂組的血糖值較DN組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表1　各組大鼠飲水量、尿量、體質(zhì)量變化值的比較

表1　各組大鼠飲水量、尿量、體質(zhì)量變化值的比較

注：與空白組比較，*P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.01。

分組　n飲水量（mL）　尿量（mL）　體質(zhì)量變化值（g）空白組　11　49.00±18.23　8.33±6.52　77.40±18.92生物節(jié)律紊亂組　11　52.31±14.67　8.88±6.14　44.31±28.35* DN組　10 272.00±58.27*　88.80±22.05*　49.80±18.36* DN生物節(jié)律紊亂組　6 158.33±51.64*△39.50±28.90*△-24.20±12.24*△

表2　各組大鼠血糖值mmol/L

表2　各組大鼠血糖值mmol/L

注：與本組實(shí)驗(yàn)前比較，#P＜0.01；與空白組比較，*P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.01。

分組　n　實(shí)驗(yàn)前　實(shí)驗(yàn)后空白組　11　5.01±0.75　06.07±0.66生物節(jié)律紊亂組　11　5.14±0.68　05.99±0.80 DN組　10　5.64±0.93　35.28±7.87*#DN生物節(jié)律紊亂組　6　6.32±0.66　17.92±7.08*#△

2.3各組大鼠24 h尿蛋白測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)后的DN組及DN生物節(jié)律紊亂組的24 h尿蛋白排泄量均較實(shí)驗(yàn)前增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同時(shí)，DN生物節(jié)律紊亂組的24 h蛋白尿排泄量較DN組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3　各組大鼠24 h尿蛋白排泄量mg

表3　各組大鼠24 h尿蛋白排泄量mg

注：與本組實(shí)驗(yàn)前比較，#P＜0.01；與空白組比較，*P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.01。

分組　n　實(shí)驗(yàn)前　實(shí)驗(yàn)后空白組　11　6.90±3.23　11.72±6.91生物節(jié)律紊亂組　11　5.77±2.52　13.07±4.18 DN組　8　2.85±0.69　23.71±5.82#* DN生物節(jié)律紊亂組　6　4.20±2.16　41.00±8.21#*△

2.4各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)比較結(jié)果顯示：空白組腎小球結(jié)構(gòu)及體積正常，腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)正常無(wú)增生；生物節(jié)律紊亂組腎小球體積較空白組大，腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)略有增生；DN組腎小球體積增大，系膜增生明顯，系膜細(xì)胞增多，腎小管上皮細(xì)胞腫脹；DN生物節(jié)律紊亂組腎小球體積明顯肥大，系膜增生更加明顯，系膜細(xì)胞明顯增多，腎小管上皮細(xì)胞較DN組更加腫脹。見圖1、圖2。

2.5各組大鼠cAMP、cGMP、cAMP/cGMP含量變化

與空白組相比，DN組大鼠cAMP含量降低（P＜0.05）；DN生物節(jié)律紊亂組大鼠cGMP含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），cAMP/cGMP比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)，與DN組相比，DN生物節(jié)律紊亂組cAMP升高，cGMP的含量升高，cAMP/cGMP比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

圖1　各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)比較（HE染色×200）

圖2　各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)比較（PAS染色×200）

表4　各組大鼠血清環(huán)核苷酸含量變化比較

表4　各組大鼠血清環(huán)核苷酸含量變化比較

注：與空白組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與DN組比較，△P＜0.05。

分組　n cAMP（nmol/L）cGMP（nmol/L）cAMP/cGMP空白組　11 90.63±10.14　23.20±4.39　3.99±0.62生物節(jié)律紊亂組　11 83.80±08.70　24.88±5.07　3.54±0.98 DN組　10 81.36±11.51*23.39±5.48　3.71±1.21 DN生物節(jié)律紊亂組　6 97.49±33.34△　38.68±15.75*△2.76±0.94#△

3　討論

DN目前逐漸成為維持性透析的主要原因，最終引起尿毒癥，進(jìn)行病因病機(jī)的探究，是防治DN的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。DN屬于中醫(yī)“消渴”、“虛勞”病的范疇，其基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，陰虛燥熱，病變臟腑以腎為主［7］。消渴證候的一般演變規(guī)律是，初起常以津傷燥熱為主，隨著病程的進(jìn)展，引起陰精虧損，進(jìn)而出現(xiàn)耗氣傷陰，病情日久則演變?yōu)殛庩?yáng)兩虛之證［2，8］。

當(dāng)今激烈的社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)使人們的工作和生活在巨大的壓力下，越來(lái)越多的人生活不規(guī)律，從而破壞內(nèi)在生物節(jié)律［9］。生物節(jié)律紊亂屬于中醫(yī)病因“起居無(wú)節(jié)”的范疇，本課題組既往的文獻(xiàn)研究結(jié)果提示［10］，“起居無(wú)節(jié)”常表現(xiàn)為晝?nèi)者^勞，夜不靜息，其通過影響人體的氣血功能，導(dǎo)致機(jī)體臟腑功能受損，促進(jìn)疾病的發(fā)生與發(fā)展。在DN的發(fā)展中，生物節(jié)律紊亂極有可能加重氣陰虧虛這一發(fā)展進(jìn)程。

現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展有助于解開“氣陰虧虛”的生物學(xué)本質(zhì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在糖尿病“氣陰虧虛”階段，大鼠飲食量、尿量比糖尿病初期階段減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢［11］。1971年，Sutherland EW教授發(fā)現(xiàn)cAMP作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)與物質(zhì)代謝［12］。cAMP、cGMP在細(xì)胞代謝及多種生理效應(yīng)的體現(xiàn)中具有關(guān)鍵的作用。1973年，美國(guó)生物學(xué)家Goldberg根據(jù)cAMP、cGMP這一對(duì)環(huán)核甘酸對(duì)細(xì)胞功能的相互對(duì)抗、相互制約，保持一定比例關(guān)系和相對(duì)平衡作用，提出了“陰陽(yáng)學(xué)說與cAMP和cGMP雙向調(diào)節(jié)關(guān)系的假說”，認(rèn)為這可代表“陰陽(yáng)學(xué)說”物質(zhì)基礎(chǔ)［13］。較多研究表明，不論是脾氣（陽(yáng)）虛弱或腎陽(yáng)衰微，均有cAMP的表達(dá)降低，cGMP值高于正常，cAMP/cGMP比值較正常值低［14］。而在陰虛時(shí)，主要是cAMP含量升高，不一定伴有cAMP/cGMP比值升高［15］。

光線對(duì)生物節(jié)律的影響至關(guān)重要［16］，本研究通過光暗顛倒改變糖尿病腎病大鼠的外界自然光照環(huán)境模擬DN生物節(jié)律紊亂模型，發(fā)現(xiàn)生物節(jié)律紊亂影響DN大鼠飲食量、尿量及體質(zhì)量的增長(zhǎng)，增加DN大鼠腎臟組織病理改變，同時(shí)DN生物節(jié)律紊亂組的24 h尿蛋白排泄量較DN組上升，由于蛋白尿的多少在一定程度上反應(yīng)DN的嚴(yán)重程度［17-18］，提示生物節(jié)律紊亂可以促進(jìn)糖尿病腎病“氣陰虧虛”進(jìn)程的發(fā)展。DN大鼠的cAMP相較空白組降低，提示在糖尿病腎病后期，“耗氣”這一病機(jī)更加嚴(yán)重。同時(shí)，生物節(jié)律紊亂DN大鼠相較DN大鼠的cAMP值升高，cGMP值升高，cAMP/cGMP比值降低，提示在糖尿病腎病進(jìn)程中，生物節(jié)律紊亂將通過“耗氣傷陰”這一病機(jī)過程加重DN的“氣陰虧虛”，進(jìn)而加重DN惡化及腎臟纖維化。具體引起cAMP/cGMP變化的分子機(jī)制值得進(jìn)一步的探索。

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Preliminary mechanism study of disruption of chronobiological rhythm promoting diabetic nephropathy through“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis:verification in animal experiments

CHEN Gang-yi1，WEN Shu-ting2，LIN Yu2，LI Wen-qing2，LI Ming-shun2，WANG Jun-yue3，WEN Hui-hong2，NING Wei-jie2
（1.The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.The Second Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

［Objective］To observe the effect of“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis in chronobiological rhythm disordered diabetic nephropathy rats.［Methods］Sixty-four Male Sprague Dawley（SD）rats were randomly divided into normal control group，chronobiology disorder group，diabetic nephropathy（DN）group，and DN chronobiology disorder group（n=16 in each group）.DN rats and chronobiology disorder DN rats were injected intraperitoneally with a low dose streptozotocin（STZ）dissolved in saline sodium citrate（SSC）repeatly and fed with high-fat food.After establishing DN models in eight weeks，chronobiology disorder were induced by changing illumination rhythm in chronobiology disorder rats and DN chronobiology disorder rats for six weeks.The drinking volume，urine volume and the change of weight were recorded.The blood glucose，24 h urinary protein excretion，theratio of cAMP and cGMP were measured，then，to observe the pathological changes of the kidney，histology of the kidney sections stained with hematoxylin-eosin and Periodic Acid-Schiff were used.［Results］①Compared with those in control group，the drinking volume，urine volume，blood glucose，24 h urinary protein excretion significantly increased in DN group and DN chronobiology disorder group（P＜0.01），the expression of cAMP decreased in DN group（P＜0.05，the expression of cGMP increased（P＜0.05）and the ratio of cAMP and cGMP significantly decreased（P＜0.01）in DN chronobiology disorder group.②In contrast to the mice in DN group，the drinking volume，urine volume and blood glucose significantly decreased and 24h urinary protein excretion significantly increased（P＜0.01），the results of renal pathological showed developed renal lesions，the expression of cGMP increased and the ratio of cAMP and cGMP decreased（P＜0.05）in DN chronobiology disorder group.［Conclusion］The disruption of chronobiological rhythm may promote diabetic nephropathy through“deficiency of Qi and Yin”pathogenesis.

disruption of chronobiological rhythm；diabetic nephropathy；the ratio of cAMP and cGMP；deficiency of Qi and Yin；pathogenesis discussion

R587.1

A

1673－9043（2015）02－0091-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.07

廣東省大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)資助項(xiàng)目（1057213003）。

陳剛毅（1975-），男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樘悄虿∧I病臨床與基礎(chǔ)研究。

溫淑婷，E-mail:wsttingzi@163.com。

（2014-11-05）