王亞飛，馮　霞，馬　莉，韓　鋒，高　靜，鄧晉麗

復(fù)方燈盞頭痛片提取物的活性篩選*

王亞飛1，馮霞1，馬莉2，3，韓鋒2，3，高靜2，3，鄧晉麗1

（1.天津大學(xué)理學(xué)院，天津300073；2.天津藥物研究院，天津300193；3.中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室（天津），天津300193）

［目的］對(duì)不同工藝制備的復(fù)方燈盞頭痛片提取物進(jìn)行藥效學(xué)比較研究。［方法］采用小鼠水浴甩尾反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、醋酸致小鼠扭體實(shí)驗(yàn)、硝酸甘油致小鼠偏頭痛模型以及利血平低5-HT化小鼠偏頭痛模型，對(duì)不同提取工藝所得復(fù)方提取物進(jìn)行藥效學(xué)篩選。［結(jié)果］3種工藝提取物均能有效提高甩尾潛伏期，抑制小鼠的扭體反應(yīng)，具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，其中以醇提物組效果最為顯著；在硝酸甘油致小鼠偏頭痛實(shí)驗(yàn)中，醇提物高低劑量組均能明顯減少小鼠撓頭次數(shù)，水提物及醇水雙提物只有高劑量組可明顯減少小鼠撓頭次數(shù)（P＜0.05）；利血平低5-HT化小鼠偏頭痛模型實(shí)驗(yàn)中，3種提取物均可提高腦組織及血液中5-HT的含量，其中以醇提物提升效果最為顯著。［結(jié)論］相同劑量的復(fù)方醇提物藥效活性優(yōu)于水提物及醇水雙提物，醇提工藝為其較優(yōu)提取工藝，可作進(jìn)一步研究和開發(fā)。

提取工藝；復(fù)方燈盞頭痛片提取物；偏頭痛；動(dòng)物模型；鎮(zhèn)痛

偏頭痛是一種臨床最常見的原發(fā)性頭痛類型，以發(fā)作性搏動(dòng)性頭痛為特征，發(fā)作呈密集性、間歇性［1］。主要表現(xiàn)為一側(cè)或雙側(cè)頭部跳動(dòng)，伴有惡心、嘔吐等植物神經(jīng)癥狀［2］。在中醫(yī)學(xué)中，偏頭痛屬于“頭風(fēng)”、“偏頭風(fēng)”范疇［3］。復(fù)方燈盞頭痛片為純中藥制劑，主要由燈盞細(xì)辛、川芎、白芷、獨(dú)一味等6味中藥組成。君藥燈盞細(xì)辛系菊科植物短亭飛蓬的干燥全草，性寒、味苦、微辛，具有散寒解表、祛風(fēng)除濕、活絡(luò)止痛之功效［4］，主治感冒、頭痛、鼻塞、風(fēng)濕痹痛、癱瘓、小兒疳積、跌打損傷等。川芎、白芷是治療偏正頭痛的常用藥物，常配伍使用，運(yùn)用廣泛［5-7］。獨(dú)一味系唇形科獨(dú)一味屬植物，全草入藥，性味甘，苦，平，具有活血祛瘀，消腫止痛之功效，常用于治療各種外科手術(shù)后的刀口疼痛、出血、風(fēng)濕痹痛等，是藏族習(xí)用藥材之一。本研究對(duì)不同提取工藝復(fù)方燈盞頭痛片提取物進(jìn)行藥效學(xué)考察，以期優(yōu)選出對(duì)偏頭痛治療效果顯著的提取工藝，為其進(jìn)一步開發(fā)和利用提供實(shí)驗(yàn)支撐。

1　材料

1.1動(dòng)物健康KM小鼠，等級(jí)為SPF級(jí)，體質(zhì)量為18～20 g，雌雄各半，購(gòu)于天津市津南區(qū)春樂(lè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（軍）2009-003。

1.2藥物燈盞細(xì)辛購(gòu)于云南，經(jīng)含量測(cè)定符合藥典要求。其余各味藥購(gòu)于天津市中藥飲片廠。

復(fù)方醇提物制備：取燈盞細(xì)辛等6味中藥，加10倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1 h。醇提液合并，減壓濃縮至濃度為每克含生藥1.40 g的浸膏，備用。

復(fù)方水提物制備：取燈盞細(xì)辛等6味中藥，加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。乙醇沉淀，取濾液減壓濃縮至濃度為每克含生藥2.27 g的浸膏，備用。

復(fù)方醇水雙提物制備：取燈盞細(xì)辛等6味中藥，加8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次1 h。醇提液待用。藥渣加8倍量水，煎煮2次，每次1 h。60%乙醇沉淀，濾液與醇提液合并，減壓濃縮濃度為每克含生藥1.5 g的浸膏，備用。

1.3藥品與試劑氯化鈉注射液（河北天成藥業(yè)股份有限公司，E13080407）。尼美舒利（天津藥物研究院藥業(yè)有限責(zé)任公司，130508），以生理鹽水制成0.498 mg/mL溶液。硝酸甘油注射液（每毫升含硝酸甘油5 mg，北京益民藥業(yè)有限公司，20121123）。利血平注射液（每毫升含利血平1mg，天津金耀氨基酸有限公司，20100930），乙醇（藥用級(jí)），5-羥色胺（5-HT）為Sigma產(chǎn)品，其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4儀器電子分析天平（AB204-N，Metter Toledo科技有限公司），電子天平（YP3001N，上海精密科學(xué)儀器有限公司），調(diào)溫電熱套（ZDHW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司），恒溫水浴鍋（TDA-8002，余姚市東方電工儀器廠），真空干燥箱（82A型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠），電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（DY89-I，寧波新芝生物科技股份有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（R501B，無(wú)錫市星海王生化設(shè)備有限公司），熒光分光光度儀（F95S，上海棱光技術(shù)有限公司），秒表（CASIO，HS-3V）

2　方法

2.1小鼠水浴甩尾反應(yīng)實(shí)驗(yàn)選用閾值合格的KM小鼠80只，隨機(jī)均分成8組，雌雄各半，陽(yáng)性藥（尼美舒利）組按表1所示劑量灌胃給藥；第3～8組為實(shí)驗(yàn)組，分別口服灌胃復(fù)方醇提物、水提物及醇水雙提物（給藥劑量見表1），對(duì)照組給予等容積生理鹽水。每日1次，連續(xù)給藥3 d。于實(shí)驗(yàn)前及末次給藥1 h及3 h分別將小鼠尾尖1.5 cm浸入恒溫水浴中（55±0.5）℃，用秒表記錄鼠尾自浸入水中到出現(xiàn)甩尾動(dòng)作的時(shí)間，作為甩尾反應(yīng)潛伏期。

2.2醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)取健康KM小鼠80只，分組、給藥方法及劑量同2.1項(xiàng)。末次給藥30 min后，各組小鼠均靜脈注射0.7%醋酸溶液（10 mL/kg）［8-11］，記錄注射醋酸溶液后，第2個(gè)10 min內(nèi)的扭體次數(shù)。

2.3硝酸甘油致小鼠偏頭痛模型實(shí)驗(yàn)取健康KM小鼠90只，隨機(jī)均分成9組，雌雄各半，陽(yáng)性藥組及實(shí)驗(yàn)組給藥方法及劑量同2.1項(xiàng)，空白對(duì)照組和模型組均給予等容積生理鹽水。末次給藥30 min后，除空白對(duì)照組外其余各組小鼠均皮下注射硝酸甘油注射液（10 mg/kg），復(fù)制實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型，造模后，小鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多等行為癥狀表明偏頭痛動(dòng)物模型制作成功［12］。記錄注射硝酸甘油注射液后，第2個(gè)20 min內(nèi)小鼠的撓頭次數(shù)。

2.4利血平致小鼠偏頭痛模型實(shí)驗(yàn)取健康KM小鼠90只，分組、給藥劑量方法同2.3項(xiàng)，除空白對(duì)照組外其余各組小鼠均皮下注射利血平10 mg/kg，連續(xù)14 d。從第7天起，實(shí)驗(yàn)組分別灌胃復(fù)方醇提物、水提物及醇水雙提物，空白對(duì)照組和模型組給予等容積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7 d，陽(yáng)性藥對(duì)照組實(shí)驗(yàn)當(dāng)日按表4所示劑量口服灌胃給藥1次。于第14天給藥1 h后，摘眼球取血，而后脫頸椎處死動(dòng)物，迅速分離腦組織，操作在冰臺(tái)上完成。測(cè)定時(shí)，用勻漿器制備腦組織勻漿液（在冰浴中）。熒光法測(cè)定腦組織及血液中5-HT含量［13-14］。

3　結(jié)果

3.1對(duì)小鼠水浴甩尾反應(yīng)的影響給藥前各組甩尾潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。給藥后各組與對(duì)照組比較，3種提取工藝所得提取物均可有效延長(zhǎng)小鼠甩尾反應(yīng)潛伏期，給藥3 h后仍有效，鎮(zhèn)痛效果良好。其中醇提物高劑量組效果最為顯著（P＜0.001），見表1。

表1　復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)小鼠水浴甩尾反應(yīng)的影響

表1　復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)小鼠水浴甩尾反應(yīng)的影響

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.001，#P＜0.01，△P＜0.05。

給藥后不同時(shí)間甩尾潛伏期（s）1 h　3 h對(duì)照組　—　1.625±0.206　1.62±0.23　1.64±0.23陽(yáng)性藥組　5×10-3　1.627±0.209　2.28±0.46#　2.25±0.48#醇提物低劑量　0.62　1.632±0.198　1.95±0.35△　2.00±0.35△醇提物高劑量　1.23　1.612±0.214　2.20±0.46#　2.21±0.35*水提物低劑量　0.62　1.634±0.226　1.88±0.36　1.93±0.37水提物高劑量　1.23　1.622±0.210　1.95±0.36△　2.12±0.47△醇水雙提物低劑量　0.62　1.634±0.254　1.93±0.45　1.93±0.39醇水雙提物高劑量　1.23　1.624±0.206　2.01±0.41△　2.02±0.36△組別　給藥劑量（g/kg）給藥前甩尾潛伏期（s）

3.2對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響與對(duì)照組比較，3種提取工藝提取物均能有效抑制醋酸導(dǎo)致的小鼠扭體反應(yīng)（P<0.05），具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。復(fù)方醇提物能顯著抑制小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05），其中高劑量組效果最顯著（P＜0.01），其余兩種提取工藝只有高劑量組能減少小鼠扭體次數(shù)（P＜0.05），見表2。說(shuō)明復(fù)方燈盞頭痛片具有一定的鎮(zhèn)痛效果，醇提物鎮(zhèn)痛效果更顯著。

3.3對(duì)硝酸甘油致偏頭痛小鼠撓頭次數(shù)的影響造模后各組小鼠較空白對(duì)照組均出現(xiàn)前肢頻繁搔頭、爬籠次數(shù)增多，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)性偏頭痛小鼠模型制作成功。與模型組比較，復(fù)方醇提物可明顯減少硝酸甘油致模型小鼠的撓頭次數(shù)（P＜0.05），其中高劑量組效果更顯著（P＜0.01）；復(fù)方水提物及雙提物高劑量組可顯著減少小鼠撓頭次數(shù)（P＜0.05），低劑量組則無(wú)明顯抑制作用。見表3。

表2　復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響（x±s，n=10）

表2　復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)醋酸致小鼠扭體的影響（x±s，n=10）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01，#P＜0.05。

組別　給藥劑量（g/kg）　扭體數(shù)（次）對(duì)照組　—　20.3±9.7陽(yáng)性藥組　5×10-3　9.7±4.6*醇提物低劑量　0.62　10.3±4.2#醇提物高劑量　1.23　7.6±3.9*水提物低劑量　0.62　13.1±6.9水提物高劑量　1.23　10.7±5.7#醇水雙提物低劑量　0.62　14.7±6.6醇水雙提物高劑量　1.23　10.8±4.6#

表3　復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)硝酸甘油致偏頭痛小鼠撓頭次數(shù)的影響

表3　復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)硝酸甘油致偏頭痛小鼠撓頭次數(shù)的影響

注：與模型組比較，*P＜0.01，#P＜0.05。

組別　給藥劑量（g/kg）　撓頭數(shù)（次）空白對(duì)照組　—　9.1±3.95*模型組　—　23.7±10.10陽(yáng)性藥組　5×10-3　13.6±6.00#醇提物低劑量　0.62　15.1±7.60#醇提物高劑量　1.23　12.3±6.80*水提物低劑量　0.62　18.9±9.10水提物高劑量　1.23　15.7±5.60#醇水雙提物低劑量　0.62　19.1±9.00醇水雙提物高劑量　1.23　15.8±5.70#

3.4對(duì)偏頭痛模型小鼠5-HT水平的影響與模型組比較，3種提取工藝所得復(fù)方提取物均能顯著升高模型小鼠腦內(nèi)及血液中的5-HT水平。其中醇提物對(duì)5-HT水平的影響最為明顯（P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05），見表4。

表4　對(duì)偏頭痛模型小鼠腦內(nèi)及血中5-HT的影響

表4　對(duì)偏頭痛模型小鼠腦內(nèi)及血中5-HT的影響

注：與模型組比較，*P＜0.001，#P＜0.01，△P＜0.05。

血液中含量（μg/g）模型組　-　0.032±0.018　0.082±0.025陽(yáng)性藥組　5×10-3　0.068±0.022#　0.145±0.044#醇提物低劑量　0.62　0.057±0.0201△　0.135±0.048#醇提物高劑量　1.23　0.070±0.029#　0.153±0.046*水提物低劑量　0.62　0.048±0.0233　0.132±0.050△水提物高劑量　1.23　0.058±0.021△　0.151±0.048#醇水雙提物低劑量　0.62　0.050±0.020　0.134±0.049△醇水雙提物高劑量　1.23　0.056±0.019△　0.149±0.051#組別　給藥劑量（g/kg）腦中含量（μg/g）

4　討論

中藥復(fù)方復(fù)雜的有效成分，一直困擾科研工作者對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行闡明，即使作用機(jī)制較為清楚的復(fù)方，其藥效也是多種有效成分協(xié)同作用的結(jié)果。偏頭痛屬于中醫(yī)“頭風(fēng)”的范疇，為內(nèi)傷頭痛。中醫(yī)辨證認(rèn)為，頭風(fēng)是由風(fēng)火上攻頭目、痰濁中阻、瘀阻經(jīng)絡(luò)、血行不暢引起的，一般頭風(fēng)病的發(fā)作期以風(fēng)、痰、瘀、熱為主，緩解期則多見虛和瘀［15-18］。本方以行氣通脈，祛風(fēng)、平肝息風(fēng)、化瘀止痛為原則諸藥合用［19］，觀察其對(duì)偏頭痛模型小鼠的藥效學(xué)影響。

本實(shí)驗(yàn)初步考察了復(fù)方燈盞頭痛片不同工藝提取物的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)實(shí)驗(yàn)性偏頭痛模型小鼠的影響。在小鼠水浴甩尾及醋酸致小鼠扭體鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中，不同工藝提取物均表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用，其中以醇提物組鎮(zhèn)痛作用最為明顯。硝酸甘油致小鼠偏頭痛模型實(shí)驗(yàn)顯示，復(fù)方醇提物高低劑量組均能明顯減少小鼠撓頭次數(shù)，水提物和醇水雙提物只有高劑量組可明顯減少小鼠撓頭次數(shù)，低劑量組對(duì)小鼠撓頭次數(shù)均無(wú)明顯抑制作用。不同復(fù)方提取物能顯著提高腦組織及血液中5-HT的含量，其中以醇提物提升效果最為顯著。

提取工藝是影響中藥復(fù)方制劑藥效好壞的影響因素之一。不同提取工藝復(fù)方燈盞頭痛片提取物對(duì)小鼠偏頭痛影響的結(jié)果顯示，復(fù)方燈盞頭痛片醇提物藥效活性優(yōu)于另外兩種工藝提取物，鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng)，對(duì)偏頭痛的治療效果更優(yōu)。不同提取工藝的藥效差異主要是提取物有效成分的含量和多個(gè)有效成分間比例的差別，本研究下一步擬采用HPLC、UV-VIS等技術(shù)，對(duì)不同提取工藝提取物的有效成分進(jìn)行分析，并結(jié)合其他藥效學(xué)指標(biāo)、生產(chǎn)成本等，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步篩選優(yōu)化出一條合理有效的復(fù)方燈盞頭痛片提取路線。

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Comparative studies on pharmacological effects of compound erigeron headache tablet with different extraction techniques

WANG Ya-fei1，MA Li2，3，HAN Feng2，3，GAO Jing2，3，DENG Jin-li1
（1.School of Science，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 300193，China；3.National&Local United Engineering Laboratory of Modern Preparation and Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine（Tianjin），Tianjin 300193，China）

［Objective］To compare pharmacological properties of different extracts of compound erigeron headache tablet and to select the optimum extracting technique.［Methods］The method of acetic acid twisting and thrilling test were adopted in the research of analgesic effect，one mice migraine model was induced by nitroglycerin（10 mg/kg）and the other was duplicated by subcutaneous injection of reserpine，and then were treated with the extracts of compound.［Results］The extracts of compound erigeron headache tablet could significantly prolong the latency of thrilling，also could decrease the number of twisting，and had an obvious analgesic effect，the alcohol extracts in high dosage group were more effective than the others.The experiments of therapeutical effect showed that the alcohol extracts could both reduce the number of scratching.Water extracts and alcohol-water extracts only worked in high dosage group（P＜0.05）.The extracts could significantly increased 5-HT level，and the alcohol extracts group were more effective than the others.［Conclusion］The pharmacological effects of alcohol extracts are better than the other two in the same dose，the extraction method of alcohol is the optimum extraction technique.It is worth further researching and developing.

extraction technique；compound erigeron headache tablet；migraine；mice models；analgesic

R285.6

A

1673－9043（2015）02－0100-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.09

天津市科技支撐計(jì)劃（12ZCDZSY19100）。

王亞飛（1990-），女，碩士，主要從事中藥新藥方向的研究。

馮霞，E-mail:f_x@tju.edu.cn.com；馬莉，E-mail:zhihua504@163.com。

（2014-10-25）