李洪芹，馬昌豪，彭艷麗

山東玫瑰花核糖體rDNA ITS序列分析初步探究*

李洪芹1，馬昌豪2，彭艷麗3

（1.菏澤學(xué)院，菏澤274015；2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，菏澤274000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355）

［目的］分析不同種質(zhì)玫瑰花（Rosae Rugosae Flos）核糖體DNA的ITS序列，為其種質(zhì)資源分子鑒別提供依據(jù)。［方法］采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)獲得ITS基因，進(jìn)行測序，經(jīng)CLUSTALX（2．0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各樣本間的遺傳距離。［結(jié)果］各樣品間遺傳距離范圍為0.000～0.011，各樣本不僅在非編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2存在多個(gè)變異位點(diǎn)，而且在保守的5.8S編碼區(qū)也存在變異位點(diǎn)。［結(jié)論］ITS序列的測定為玫瑰花品種鑒別和種質(zhì)資源優(yōu)化提供分子生物學(xué)依據(jù)。

玫瑰花；rDNA；ITS序列

玫瑰花（Rosae Rugosae Flos）為薔薇科薔薇屬多年生灌木玫瑰（Rosa rugosa Thunb．）的干燥花蕾，在中國有悠久的應(yīng)用歷史，具有理氣解郁、活血止痛的功效［1］。作為一種藥材，玫瑰花還有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，廣泛應(yīng)用于花卉觀賞和精油、天然色素的提取等，具有重要開發(fā)研究價(jià)值。中國玫瑰種質(zhì)資源十分豐富，栽培歷史長達(dá)數(shù)百年，雜交品種較多，蔡芳［2］通過AFLP分子標(biāo)記技術(shù)研究玫瑰種質(zhì)資源的遺傳多樣性，親緣關(guān)系及其系統(tǒng)關(guān)系，顧一珠等［3］對不同栽培品種玫瑰花藥材進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析，目前還未見關(guān)于玫瑰花rDNA ITS序列分析的相關(guān)報(bào)道。

ITS是核糖體基因中，位于核糖體18S、5.8S和26S之間轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的DNA片段，被5.8S分割成2段，由于不加入成熟的核糖體，收到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度較快，但在被子植物中相對長度具有保守性，適合用于低分類群的系統(tǒng)發(fā)育分析［4-6］，因而ITS序列廣泛用于被子植物系統(tǒng)學(xué)的研究，尤其是近源屬間和屬內(nèi)系統(tǒng)學(xué)的研究［7-13］。近年來ITS序列也作為鑒定性狀，根據(jù)遺傳物質(zhì)DNA在不同生物個(gè)體的差異來鑒別生物物種［14-17］，在川牛膝［18］、遠(yuǎn)志［19］、紫花地?。?0］等植物藥中得到探討和應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)對7個(gè)玫瑰花栽培品種進(jìn)行rDNA ITS序列測定與分析，從分子水平比較不同栽培品種玫瑰花的差異，為玫瑰的種質(zhì)資源的鑒定、質(zhì)量控制以及玫瑰的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

實(shí)驗(yàn)所用藥材嫩葉均為2011年采自平陰玫瑰園，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)彭艷麗教授鑒定。1為北京妙峰山重瓣白玫瑰，2為北京妙峰山單瓣白玫瑰，3為傳統(tǒng)玫瑰，4為保加利亞白玫瑰，7為苦水玫瑰，8為豐花一號，9為紫枝玫瑰。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（加拿大BBI公司），3730測序列分析儀（美國ABI公司），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠），DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司），YXJ-2離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司），H6-1微型電泳槽（上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司），U-3010紫外-可見分光光度計(jì)（Hitachi公司），移液器（范圍100～1 000 mL，20～200 mL，0.5～10 mL）（加拿大BBI公司）。

1.1總DNA提取稱取100 mg新鮮嫩葉，液氮中充分研磨成粉。然后按照上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取，提取的DNA溶液置于-20℃保存。

1.2PCR擴(kuò)增、純化與測序

1.2.1PCR擴(kuò)增體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)在50 μL體系中完成，反應(yīng)液含有Template（基因組）10 pmol，Primer up（10 μmol/L）1 μL，Primer down（10 μmol/L）1 μL，dNTP mix（10 mmol/L each）1 μL，10×Taq reaction Buffer 5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.25 μL，加滅菌雙蒸餾水至50 μL。

1.2.2 PCR程序設(shè)定擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5min；循環(huán)95℃變性35 s，55℃復(fù)性35 s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后；72℃延伸8 min。

1.2.3引物的選擇擴(kuò)增ITS序列引物依據(jù)文獻(xiàn)［21］設(shè)計(jì)，引物序列為：ITS1 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3‘ 19bp ITS4 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’20 bp擴(kuò)增結(jié)果見圖1，從擴(kuò)增的結(jié)果看，7種玫瑰花都能得到一條清晰的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增帶。

圖1　PCR擴(kuò)增后電泳圖譜

1.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物的回收與純化由PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果切割所需DNA目的條帶，采用UNIQ-10柱式膠回收試劑盒（SK1131）回收純化。根據(jù)說明書操作，回收產(chǎn)物可立即使用或保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5目的DNA片段的測序?qū)@得的目的片段序列進(jìn)行序列測定，用3730測序列分析儀進(jìn)行測序，每個(gè)樣品均采用雙向測序，獲得7個(gè)種的ITS序列信息。

1.2.6ITS序列分析用CLUSTALX（2.0）程序?qū)ξ慌帕蠭TS序列，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA4計(jì)算遺傳距離標(biāo)準(zhǔn)方差。

2　結(jié)果與分析

2.1ITS長度與GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較本實(shí)驗(yàn)測得的7個(gè)樣品ITS（包括5.8S）序列的長度與G+C含量，見表1。

表1　樣品序列長度及G+C含量

各樣品ITS（包括 5.8S）G+C含量范圍為57.25%～59.19%，所有種的5.8S編碼區(qū)序列長度為163 bp。G+C含量差異較大，預(yù)示堿基位點(diǎn)發(fā)生某種程度的變化。

2.2基于ITS分析各樣品間遺傳距離各樣品間遺傳距離和標(biāo)準(zhǔn)方差，見表2，左下方為遺傳距離，右上部為標(biāo)準(zhǔn)方差。

表2　各樣品間遺傳距離

通過對比發(fā)現(xiàn)，各樣品間遺傳距離均較小，范圍為0.000～0.011，標(biāo)準(zhǔn)誤差范圍為0.003～0.005。

通過參照Genebank中玫瑰花ITS序列（登錄號：FJ527709.1），確定 7個(gè)樣品的 ITS區(qū)位置，F(xiàn)J527709.1共測得ITS序列共696 bp，其中33～286為ITS 1序列，287～450為5.8S序列，451～658為ITS 2序列。從ITS整體變異情況看，各樣本不僅在非編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2存在多個(gè)變異位點(diǎn)，而且在保守的5.8S編碼區(qū)也存在變異位點(diǎn)。在5.8S區(qū)（163 bp）變異位點(diǎn)很少（變異位點(diǎn)序號均以FJ527709.1為標(biāo)準(zhǔn)），只有豐花一號（888號樣品）在286位、409位上堿基與其他樣品不同，在這兩個(gè)位點(diǎn)豐花一號堿基為A，而其他樣品為C，可以考慮將286和409位作為鑒別豐花一號的特異性分子標(biāo)記，其可靠性還需進(jìn)一步研究證實(shí)。在ITS1區(qū)中，苦水玫瑰（777號樣品）可分析序列變異位點(diǎn)主要集中在137位（T-C）、155位（C-G）、174位（A-G）、229位（缺失）；在ITS2區(qū)有較多的堿基缺失和調(diào)換，主要集中在466～470位：傳統(tǒng)玫瑰（333號樣品）在466位、467位、468位堿基缺失；北京妙峰山重瓣白玫瑰（111號樣品）在466位、467位、468位堿基替換（C-A）；保加利亞白玫瑰（444號樣品）、苦水玫瑰（777號樣品）、豐花一號（888號樣品）、紫枝玫瑰（999號樣品）在468位、469位、470位堿基缺失；北京妙峰山單瓣白玫瑰（222號樣品）在466位、469位、470位堿基替換（A-C）；苦水玫瑰（777號樣品）在475位、561位堿基缺失。序列對比見圖2。

結(jié)果表明不同品種玫瑰花的ITS序列有一定的差異，所以玫瑰花的ITS序列（ITS及5.8S rDNA）分析資料可為玫瑰花的品種鑒別及分類提供新的手段。

3　小結(jié)

該實(shí)驗(yàn)通過對玫瑰花常見種類的葉片進(jìn)行核糖體rDNA ITS序列分析，證明該技術(shù)可以作為一個(gè)鑒別玫瑰花不同品種和種質(zhì)資源優(yōu)化的分子生物學(xué)依據(jù)。通過序列分析，可以考慮將豐花一號5.8S區(qū)第286位和409位堿基作為鑒別豐花一號的堿基鑒別位點(diǎn)；苦水玫瑰作為一個(gè)中國傳統(tǒng)玫瑰的變種在ITS1區(qū)有4個(gè)變異位點(diǎn)，同時(shí)在ITS2區(qū)有兩個(gè)位點(diǎn)的堿基缺失；7個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品在ITS2區(qū)共5個(gè)位點(diǎn)有堿基缺失和替換，主要集中在466～470位。豐花一號、苦水玫瑰作為玫瑰花在市場上種植面積較大、推廣較為成功的品種，通過該技術(shù)建立的分子標(biāo)記，更有助于兩品種的推廣。

由于時(shí)間和條件限制，并沒有采集到所有常見玫瑰花品種，如保加利亞紅玫瑰、大馬士革玫瑰、格拉斯玫瑰，因此有待于以后的樣品采集和測定工作。本實(shí)驗(yàn)對ITS測序技術(shù)在玫瑰花藥材鑒定方面進(jìn)行了初步探究，在以后的研究中可以結(jié)合形態(tài)學(xué)特性、主要有效化學(xué)成分、精油含量等指標(biāo)全面考察，為今后進(jìn)一步研究玫瑰花鑒定、新品種選育、品種優(yōu)化奠定理論基礎(chǔ)。

圖2　7種玫瑰花ITS序列比較

［1］中華人民共和國藥典委員會(huì).中國藥典（一部）［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:139

［2］蔡芳.玫瑰種質(zhì)資源與藥材鑒別研究［D］北京：北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2008.

［3］顧一珠，馬君一，李明，等玫瑰花聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒別研究［J］.藥物分析雜志，2009，29（5）:819.

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［8］金建峰，朱思眉，蔣明，等.石斛屬植物rDNA ITS序列的克隆與分析［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，6（3）:685.

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［10］趙歡，吳衛(wèi)，鄭有良，等.核糖體DNA ITS序列分析在藥用植物研究中的應(yīng)用［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20（4）:959

［11］顧慧芬，莊意麗，馬子建，等.基于ITS序列分析鐵皮石斛與近緣類群的親緣關(guān)系［J］.中成藥，2010，32（4）:628-632.

［12］朱穎，董玉芝，昝少平，等.基于ITS序列探討忍冬屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（2）:250-254.

［13］李艷萍，魏繼承，何淼，等.基于rDNA ITS序列東北地區(qū)丁香屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（8）:45-47.

［14］唐鋮，張鐵軍，劉昌孝.基于PCR技術(shù)的中藥指紋圖譜研究［J］天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（3）:162-165.

［15］商洪才，張伯禮，高秀梅.中醫(yī)藥現(xiàn)代化與分子生物學(xué)［J］.天津中醫(yī)藥，2001，18（5）:41-43.

［16］鄭守曾，王睿林.中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用（一）［J］.天津中醫(yī)藥，2005，22（3）:186-189.

［17］鄭守曾，王睿林.中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用（二）［J］.天津中醫(yī)藥，2005，22（4）:272-275.

［18］陳詩晴，蒲沁琳，陳小軍，等.基于ITS序列分析技術(shù)鑒定川牛膝與常見偽品麻牛膝［J］.中藥與臨床，2014，38（9）:4-6.

［19］樊杰，白妍，束明月.遠(yuǎn)志及其近緣種的ITS序列分析及鑒定［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，15（4）:31-32.

［20］朱燁，張春，莊元春.基于ITS序列分析對紫花地丁的分子鑒別［J］.中華中醫(yī)藥，2014，28（4）:918-920.

［21］曾明，馬雅軍，鄭水慶，等.中藥葛根及其近緣種的rDNA-ITS序列分析［J］.中國藥學(xué)雜志，2003，38（3）:173.

The pre-explore of rDNA ITS sequence of Flos Rosae Rugosae in Shandong province

LI Hong-qin1，MA Chang-hao2，PENG Yan-li3
（1．Heze University，Heze 274015，China；2.Heze Institute of Food and Drug Control，Heze 274000，China；3.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

［Objective］To provide scientific evidence for molecular identification by analyzing ITS sequences in different germplasms from Flos Rosae Rugosae.［Methods］The ITS（Internal Transcribed Spacer）regions were cloned by PCR amplification and sequenced bi-directionally.The ITS sequences were aligned by CLUSTALX（2.0）and genetic distances were calculated.［Results］The genetic distances among different germplasms ranged form 0.000 to 0.011.There were a lot of variable sites in both ITS1 and ITS1 sequences from non-coding regions，as well as 5.8S from the conservative region.［Conclusion］The phylogentic analyses based on ITS sequences can provide reliable molecular evidences for identifying different genotypic germplasms of Flos Rosae Rugosae.

Flos Rosae Rugosae；rDNA；ITS sequence

R284

A

1673－9043（2015）02－0104-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.10

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（ZR2009CM106）。

李洪芹（1987-），女，碩士研究生，助教，研究方向?yàn)樯帯⒅兴庂|(zhì)量控制和品質(zhì)評價(jià)。

彭艷麗，E-mail:py1567@163.com。

（2014-10-20）