韓忠耀，周福軍，劉　芳，侯文彬

多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)選柴胡桂枝顆粒提取工藝*

韓忠耀1，周福軍2，劉芳3，侯文彬2

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，都勻558000；2.天津藥物研究院，天津300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選柴胡桂枝顆粒處方藥材的提取工藝。［方法］以柴胡皂苷a、芍藥苷、黃芩苷及出膏率為檢測(cè)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選柴胡等藥材的乙醇回流提取工藝。［結(jié)果］柴胡桂枝顆粒乙醇回流提取的最佳提取工藝為10倍量80%乙醇提取3次，每次提取2 h。［結(jié)論］優(yōu)選的柴胡桂枝顆粒提取工藝穩(wěn)定可行，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

柴胡桂枝顆粒；正交實(shí)驗(yàn)；提取工藝；柴胡皂苷a；黃芩苷；芍藥苷

柴胡桂枝顆粒源于張仲景《傷寒論》所載“柴胡桂枝湯”處方，全方由柴胡、白芍、桂枝、黃芩、黨參、半夏、甘草、生姜、大棗組成，其中柴胡、白芍為君藥，桂枝、黃芩為臣藥，主要用于外感風(fēng)寒、發(fā)熱自汗微惡寒的治療。

現(xiàn)代研究及臨床應(yīng)用證明，柴胡桂枝湯可用于治療抑郁癥［1-5］，療效確切。方中柴胡、白芍、桂枝、黃芩等8味藥的活性成分主要為醇溶性化學(xué)成分，而大棗的活性成分呈水溶性，為盡可能地提取和保護(hù)方中活性成分，課題組經(jīng)過前期的工藝篩選、相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，并根據(jù)復(fù)方中有效成分的理化性質(zhì)和藥理作用［6-8］，將柴胡、白芍、桂枝、黃芩等8味藥進(jìn)行醇提，同時(shí)，醇提后的藥渣加上大棗采用水煎煮法提取。經(jīng)過藥效活性篩選，此工藝提取的樣品藥效較佳。本實(shí)驗(yàn)以君藥柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍藥苷和臣藥黃芩中的黃芩苷的提出量及出膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選柴胡桂枝顆粒的醇提工藝，為該顆粒劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1　材料

柴胡、白芍等藥材均購(gòu)自河北省安國(guó)市義通中藥材有限公司（批號(hào)20130901），經(jīng)天津藥物研究院現(xiàn)代中藥研究部周福軍副研究員鑒定均為正品。HP1100型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Luna C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；迪馬公司Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Sartorius BP211D型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。柴胡皂苷a對(duì)照品（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)110736－200732，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715－200212，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）。其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定參照文獻(xiàn)［9］。方中柴胡、白芍、桂枝、黃芩、半夏、甘草、生姜等8味藥的活性成分為醇溶性，采用乙醇提取。醇提部分以君藥柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍藥苷和臣藥黃芩中的黃芩苷的提出量及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評(píng)分法［10］優(yōu)選醇提工藝參數(shù)，設(shè)定柴胡皂苷a和芍藥苷的權(quán)重系數(shù)均為0.3，黃芩苷和出膏率權(quán)重系數(shù)均為0.2。

2.2柴胡皂苷a的含量測(cè)定

2.2.1色譜條件參照文獻(xiàn)［11-12］。Luna C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（30∶70），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。此色譜條件下，柴胡皂苷a與相鄰峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以柴胡皂苷a峰計(jì)不低于8 000。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取柴胡皂苷a對(duì)照品（五氧化二磷真空干燥24 h）5.06 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備參照文獻(xiàn)［13］。精密量取提取液適量，減壓濃縮至無(wú)醇味，加水調(diào)至20 mL溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取4次，每次20 mL。合并正丁醇溶液，再用氨試液充分洗滌3次，每次20 mL。將正丁醇溶液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、8、10、20 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y =124.5X+0.181（r=0.999 7），在0.506～10.12 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3芍藥苷的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件參照文獻(xiàn)［14-15］。Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水（16∶84），流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。此色譜條件下，理論塔板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)分別不低于5 000。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取芍藥苷對(duì)照品10.32 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。

2.3.3供試品溶液的制備精密吸取提取液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、2、3、4 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=11 652X+37.28（r=0.999 9），在0.04～0.82 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4黃芩苷的含量測(cè)定

2.4.1色譜條件參照文獻(xiàn)［16-17］。Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.05%磷酸水（50∶50），流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。此色譜條件下，理論塔板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)不低于5 000。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取黃芩苷對(duì)照品10.1 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。

2.4.3供試品溶液的制備精密吸取提取液適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線性關(guān)系考察精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=36 361X-8.274（r=0.999 9），在0.1～1.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5出膏率的測(cè)定參照文獻(xiàn)［18］。精密量取提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至干，置105℃烘箱中干燥3 h，取出，于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定其質(zhì)量，計(jì)算干膏收率。

2.6乙醇回流提取工藝優(yōu)化

2.6.1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)醇提部分以君藥柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍藥苷和臣藥黃芩中的黃芩苷的提出量及出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評(píng)分法優(yōu)選醇提工藝參數(shù)，設(shè)定柴胡皂苷a和芍藥苷的權(quán)重系數(shù)均為0.3，黃芩苷和出膏率權(quán)重系數(shù)均為0.2，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素選取3個(gè)水平。按處方比例稱取柴胡、白芍、桂枝、黃芩、黨參等藥材共9份，每份168 g，加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇，按L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1　柴胡桂枝顆粒乙醇回流提取工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.6.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較各因素的直觀分析可知，各因素對(duì)醇提工藝的影響的順序是D＞B＞A＞C，即提取次數(shù)＞加醇量＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，最佳工藝為：A2B3C2D3，見表2。方差分析結(jié)果表明，D、B因素對(duì)提取工藝的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表3。綜合提取成本、提取效率等考慮，確定最佳乙醇回流提取工藝為A2B3C2D3，即80%乙醇、10倍量、提取3次，每次2 h。

表2　柴胡桂枝顆粒乙醇回流提取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　柴胡桂枝顆粒乙醇回流提取工藝正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按處方比例稱取藥材3份，按優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表4。

表4　柴胡桂枝顆粒提取工藝驗(yàn)證結(jié)果

3　討論

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏不斷地加快，人們工作壓力增大、精神高度緊張，致使抑郁癥的發(fā)病率呈逐年上升之勢(shì)，抑郁癥已成為一種嚴(yán)重危害人類身心健康的精神類疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，抑郁癥已成為世界第四大疾患，預(yù)計(jì)到2020年，可能成為僅次于冠心病的第二大疾病。目前，在治療抑郁癥的藥物中化學(xué)藥物療效明顯，但由于化學(xué)合成抗抑郁藥在長(zhǎng)期服用后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，也存在著抗抑郁譜窄、易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)，故作用溫和、不良反應(yīng)少的傳統(tǒng)中藥及其方劑越來(lái)越受到人們的關(guān)注［19］。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥多為情志不舒、氣機(jī)郁滯所致［20］，以肝郁氣滯型最多［21］，故以疏肝理氣、調(diào)節(jié)情志為治法，柴胡桂枝方能疏泄肝膽，溫振少陽(yáng)，解郁除煩［22］，臨床用于治療抑郁癥取得了滿意的療效，本課題組對(duì)該方進(jìn)行藥效篩選，結(jié)果也顯示對(duì)抑郁癥有一定療效。

柴胡、白芍、黃芩單味在不同處方中的的研究工藝很多，但是一般選取1～3個(gè)指標(biāo)［23-25］來(lái)評(píng)價(jià)工藝，本文選取君藥柴胡中柴胡皂苷a、白芍中芍藥苷和臣藥黃芩中的黃芩苷的提出量及出膏率等4個(gè)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝，注重各指標(biāo)的協(xié)同效應(yīng)，符合中藥復(fù)方多靶點(diǎn)多成分起效的特點(diǎn)，較單一指標(biāo)更全面、科學(xué)、客觀地對(duì)工藝進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

柴胡桂枝顆粒全方藥材提取分為醇提取組與水煎煮組共兩組提取，本研究通過正交實(shí)驗(yàn)多指標(biāo)綜合評(píng)分法深入考察了柴胡桂枝顆粒乙醇回流提取工藝，使有效成分盡可能提取完全，發(fā)揮藥效。本實(shí)驗(yàn)方法具有工藝穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便易行、節(jié)約生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)。

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Optimization of extraction technology for Chaihu Guizhi granule by multi-index comprehensive evaluation method

HAN Zhong-yao1，ZHOU Fu-jun2，LIU Fang3，HOU Wen-Bin2
（1.Qiannan Medical College for Nationalities，Duyun 558000，China；2.Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin 3001933，China；3.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To optimize extraction process of prescription drugs from Chaihu Guizhi Granule by orthogonal test.［Methods］Ethanol extraction technology of Radix bupleurl and other herbs was optimized by orthogonal test with Saikosaponin A，baicalin，paeoniflorin and extract rate as detection index.［Results］Optimum extraction process conditions were determined as follows:Radix bupleurl and other herbs were extracted 3 times with 2 h by 10 times the amount of 80%ethanol.［Conclusion］This optimized extraction technology of Chaihu Guizhi Granule was stable and feasible，it could be extended to industrial production.

Chaihu Guizhi granule；orthogonal test；extraction technology；Saikosaponin A；baicalin；paeoniflorin

R284.2

A

1673－9043（2015）02－0108-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.11

國(guó)家“十二五”重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)課題（2014ZX09 101021）。

韓忠耀（1981-），男，碩士，主管藥師，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。

侯文彬，E-mail:houwb@tjipr.com。

（2014-11-23）