李慧影，馬亞珂，楊　岳，王　虹

·實驗研究·

漢黃芩素上調小鼠骨髓Lin-細胞Pecam1基因表達*

李慧影，馬亞珂，楊岳，王虹

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津300193）

［目的］探討漢黃芩素對小鼠骨髓Lin-細胞增殖、分化、遷移、黏附關鍵功能基因表達的影響。［方法］采用免疫磁珠法分離小鼠骨髓Lin-細胞，采用CD117作為標志進行細胞鑒定。應用實時定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）芯片技術研究漢黃芩素對小鼠骨髓Lin-細胞功能基因表達的影響。采用黏附能力測定實驗觀察Lin-細胞的黏附能力。［結果］流式細胞技術結果顯示，小鼠骨髓源性單個核細胞免疫磁珠分選后CD117的陽性率為93.7%；芯片結果發(fā)現(xiàn)漢黃芩素明顯上調Lin-細胞血小板內皮細胞黏附分子-1（Pecam1）基因表達；黏附能力測定實驗結果可見漢黃芩素增強Lin-細胞的黏附能力。［結論］免疫磁珠法分離小鼠骨髓Lin-細胞是一種較為理想的分離方法；漢黃芩素可能通過上調小鼠骨髓Lin-細胞Pecam1基因表達，從而增加Lin-細胞的黏附能力。

小鼠骨髓Lin-細胞；漢黃芩素；關鍵功能基因；黏附能力

骨髓包含不同種類的干祖細胞，如造血干細胞（HSCs）、內皮祖細胞（EPCs）以及間充質干細胞（MSCs）［1］。干細胞的表面標記素有爭議，并且不同部位的細胞標記也不相同［2-6］。

在骨髓，Lin-被認為是血液血管干細胞的基本特征。血液血管干細胞是一類具有雙向分化潛能的祖細胞，可以分化成為造血干細胞和內皮祖細胞（EPCs）［7］。同時還表達Flk+、Sca-1+、c-kit＋（CD117）的細胞具有很強的血管再生功能，被稱為EPCs［8-9］，進入組織后開始表達成熟內皮標志如血管內皮細胞鈣依黏連蛋白（VE-cadherin）和E-選擇素（E-selectin）。EPCs通過動員，歸巢，遷移，分化，增殖，黏附等生物活性作用，促進血管新生［10］。近幾年來實驗研究發(fā)現(xiàn)一些中藥單體能夠有效促進離體內皮祖細胞的黏附、趨化和增殖能力，但作用機制尚不清楚［11-12］?，F(xiàn)階段研究較多且較成熟的是中藥對MSCs的干預作用［13-14］。

漢黃芩素（wogonin）是一種重要的黃酮類化合物，具有廣泛的生物活性。本研究觀察了漢黃芩素對小鼠骨髓Lin-細胞功能基因表達的影響，旨在探討漢黃芩素對Lin-細胞增殖、分化、遷移、黏附能力是否有影響。

1　材料和方法

1.1實驗動物、主要試劑與儀器10～12周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠，每只約20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

胎牛血清、胰蛋白酶液（Biological Industries）；小鼠外周血淋巴細胞分離液、紅細胞裂解液、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液、0．5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（Solarbio）；Linege Cell Depletion Kit、PE－CD117抗體（Miltenyi Biotec）；High Pure RNA Isolation Ki（tRoche）；TaqManReverse Transcription Rengents、TaqMan?Gene Expression Master Mix、基因芯片（Applied Biosystems）；EGM－2（Lonza Clonetics）；Vitronectin、Gelatin（Sigma）；流式細胞儀（BD公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司）；MiniMACS Separator、MS Columns（Miltenyi Biotec）；ABI PRISM 7500（Applied Biosystems）；PCR C1000（BIO－RAD公司）。

1.2方法

1.2.1Lin-細胞的分離頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，浸泡75%乙醇中消毒10 min，超凈臺中無菌分離雙側股骨和脛骨，盡量剔除附著的肌肉和脂肪組織。將骨頭浸泡在D-Hank’s中，用D-Hank’s沖洗骨髓，直到?jīng)_洗液澄清為止，通過70 μm的細胞過濾器將骨髓沖洗液轉移至50 mL離心管中。以小鼠外周血淋巴細胞分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個核細胞。懸浮細胞進行細胞計數(shù)，然后根據(jù)細胞數(shù)目計算出需加入的Linege Cell Depletion試劑的量進行磁性標記并選擇合適的分選柱。磁性標記后，離心棄去上清，用緩沖液［由磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.5%牛血清白蛋白（BSA）和2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）組成，需提前一天配制］懸浮細胞。平衡柱子后，底部放陰性收集管，將標本細胞懸液加入柱中，用緩沖液清洗柱子3次（每次緩沖液與細胞懸液等量），陰性收集管中所得液體即為Lin-細胞。離心棄上清，用EGM-2全培基懸浮細胞，放置37℃、5%二氧化碳（CO）2孵箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2Lin-細胞的鑒定細胞培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶液進行消化，300×g下離心10 min收集細胞，緩沖液洗去胰蛋白酶液。100 μL緩沖液重懸細胞，加入10 μL PE-CD117抗體，2～8℃下避光孵育10 min。加入適量緩沖液洗去未結合的抗體，流式細胞儀檢測PE-CD117的表達。

1.2.3漢黃芩素對Lin-細胞關鍵功能基因表達的影響Lin-細胞分選出來后，分別向細胞中加入二甲基亞砜（DMSO）和終濃度為10-5mol/L的漢黃芩素。孵箱中孵育8 h后，采用High Pure RNA Isolation Kit提取總RNA，采用TaqManReverse Transcription Rengents試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA（20μL體系），取反轉錄產物cDNA模板2.5μL，按照TaqManGene Expression Master Mix試劑盒說明書進行實時定量PCR，測定Lin-細胞中基因相對表達量。采用2-ΔΔCt方法對實時定量PCR結果進行分析。功能基因的種類、符號及基因名見表1。

1.2.4漢黃芩素對Lin-細胞黏附能力的影響Lin-細胞分選出來后，分別向細胞中加入DMSO和終濃度為10-5mol/L的漢黃芩素。孵箱中孵育24 h后，各組細胞胰酶消化收集，以濃度為1×104個細胞/孔接種在2.5 μg/mL Vitronectin和0.5%gelatin包被的96孔板內，孵育1 h，去除非貼壁細胞，4%多聚甲醛固定貼壁細胞，DAPI染色，顯微鏡下計數(shù)，取8孔平均值，比較各組藥物對Lin-細胞黏附能力的影響。

2　結果

2.1漢黃芩素促進Lin-細胞的黏附能力與空白組比較，漢黃芩素濃度為10-5mol/L時對Lin-細胞的黏附能力有促進作用（P<0.01），見圖1。

表1　功能基因的種類、符號及基因名

2.2漢黃芩素上調Lin-細胞Pecam1基因表達以芯片技術研究漢黃芩素對Lin-細胞功能基因表達的影響，研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素上調Lin-細胞Pecam1基因表達7倍左右，見圖2、圖3。

2.3流式鑒定結果流式分析結果表明，小鼠骨髓源性單個核細胞免疫磁珠分選后CD117的陽性率為93.7%，見圖4，證實得到了高純度的Lin-細胞。

3　討論

Lin-是小鼠造血細胞常用表型之一，Lineage系列包括 CD3、CD4、CD8、B220、Gr1、Ter119、CD11b及IL-7R。CD3，CD4，CD8是T細胞的標記；B220表達于B系細胞；Gr1是粒細胞的標記；Ter119主要表達在紅細胞上；CD11b表達于巨噬細胞、自然殺傷（NK）細胞和活化的淋巴細胞；L-7R主要表達于骨髓中未成熟的B細胞［15］。Lineage系列主要表達于骨髓成熟細胞，通過Lineage-分選可去除成熟細胞。Lin-細胞同時還表達Flk+、Sca-1+、c-kit+的細胞具有很強的血管再生功能，被稱為EPCs。血液循環(huán)中含有的EPCs不僅能參與形成新的血管，并且能存在于血管新生活躍的部位［16］。EPCs在分化過程中自身分泌細胞因子，這些因子均能特異性地作用于血管內皮細胞，刺激其增殖，促進血管新生，從而改善缺血心肌的血液供應［17-18］。

圖1　漢黃芩素對Lin-細胞黏附能力的影響

圖2　漢黃芩素對Lin-細胞Pecam1基因表達的影響

圖3　漢黃芩素對Lin-細胞功能基因表達的影響

圖4　Lin-細胞表型鑒定

免疫磁性細胞分選系統(tǒng)（MACS）是一種集免疫學、細胞生物學、磁力學等為一體的高度特異性細胞分選技術，其高度特異性來自抗體對抗原的特異性識別［19］。研究表明［20］，MACS是分選效率最高的系統(tǒng)，其具有快速、高效、不影響細胞功能、操作簡便、純度及得率高等特點，已廣泛應用于基礎和臨床研究。而探針法定量PCR技術由于其準確性也已在科研領域得到更為廣泛的應用。本研究參照相關文獻分選出單個核細胞后［21-22］，選用了MACS技術得到高純度的Lin-細胞，繼而應用PCR芯片技術，篩查藥物對骨髓干/祖細胞功能基因的影響，將細胞分選技術的特異性、定量PCR技術的準確性和芯片技術的高通量相結合，既保證了細胞的干/祖細胞特征，又滿足了PCR芯片技術對細胞量的需求，從而達到篩查藥物作用靶點的目的。

本實驗選擇了38個與Lin-細胞增殖、凋亡、遷移、分化、動員、歸巢、黏附功能相關的基因見表1，應用實時定量PCR芯片技術研究發(fā)現(xiàn)在上述基因中漢黃芩素能夠顯著上調Lin-細胞Pecam1基因表達。

Gigant等［23］研究發(fā)現(xiàn)黏附分子及其受體的表達能夠調控祖細胞的動員和歸巢。本實驗發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠顯著上調Lin-細胞Pecam1基因表達，而Pecam1是存在于血管內皮細胞、血小板以及白細胞表面的一種黏附分子，參與和調節(jié)單核細胞與內皮細胞的黏附及遷移［24］。但是Pecam1的受體及其是否影響祖細胞的動員和歸巢尚沒有文獻報道。

天然產物漢黃芩素具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護、抗腫瘤和抗病毒活性等，多數(shù)研究也是從以上幾個方面開展。也有文獻報道漢黃芩素對肺腺癌A549細胞中黏附、遷移相關基因有影響［25］，但漢黃芩素對干/祖細胞是否有作用尚沒有文獻報道。故筆者用漢黃芩素對Lin-細胞的功能基因進行篩查，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠明顯上調Lin-細胞的黏附基因Pecam1的表達。

通過以上研究，結果發(fā)現(xiàn)免疫磁珠法分離小鼠骨髓Lin-細胞是一種較為理想的分離方法，漢黃芩素可能通過上調小鼠骨髓Lin-細胞Pecam1基因表達，從而增加Lin-細胞的黏附能力，因此可以推測漢黃芩素對干/祖細胞的動員、歸巢有影響，但需進一步驗證。同時，此研究提示應采用更多的細胞標記物研究藥物對EPCs作用及對藥物的載體機制進一步研究。

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Regulated Pecam1 gene expression in bone marrow-derived Lin-cells by wogonin

LI Hui-ying，MA Ya-ke，YANG Yue，WANG Hong
（Research Institute of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To explore the effects of wogonin on the proliferation，differentiation，migration，adhesion gene expression of bone Marrow-derived Lin-cells.［Method］Using magnetic activated cell sorting（MACS）to separate Lin-cells from bone marrow and using CD117 as a marker for cell identification.To investigate the effect of wogonin on functional gene expression of bone marrow-derived Lin-cells by real-time-RT-PCR array technology.Adhesion method was used to detect the effect of wogonin on the adhesion of Lin-cells.［Result］Flow cytometry results showed that，mononuclear cells derived from bone marrow of mice after MACS，the separation rate of CD117 was 93.7%.The PCR chip results showed that the gene expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1（Pecam1）of Lin-cell was significantly up-regulation by wogonin.The adhesion ability experimental result showed that wogonin could enhance the adhesion ability of Lin-cells.［Conclusion］It is an ideal separation method by using MACS to separate Lin-cells from bone marrow.Wogonin may up regulate Lin-cells in bone marrow of mice Pecam1 gene expression，thereby increasing the adhesion ability of Lin-cells.

bone marrow-derived Lin-cells；wogonin；key functional gene；adhesion ability

R285.5

A

1673－9043（2015）02－0086-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.02.06

國家自然科學基金面上項目（81173592）；新世紀優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-13-0935）；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助（IRT0973）。

李慧影（1989-），女，碩士研究生，研究方向為中醫(yī)藥治療缺血性心臟病，心血管藥理。

王虹，E-mail：wanghongsys@126.com。

（2014-11-14）