項(xiàng)雷文，陳國(guó)泰，翁佳敏，陳文韜，汪少蕓*

（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清　　350300；2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州　　350108）

HPLC-DAD結(jié)合交替三線性分解二階校正法測(cè)定荔枝果肉中游離植物甾醇

項(xiàng)雷文1，陳國(guó)泰1，翁佳敏1，陳文韜1，汪少蕓2，*

（1.福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院，福建 福清350300；
2.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州350108）

為快速測(cè)定荔枝果肉中游離植物甾醇含量，建立高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器結(jié) 合基于交替三線 性分解算法的二階校正方法。基本色譜條件：島津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)95%乙腈溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為190～340 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20.0 μL。結(jié)果表明，‘蘭竹’和‘烏葉’荔枝樣品中菜油甾醇含量分別為24.1 μg/g和27.4 μg/g，兩種荔枝樣品豆甾醇含量分別為25.8 μg/g和26.7 μg/g，菜油甾醇和豆甾醇加標(biāo)回收率分別為（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%。所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高且可靠，可用于檢測(cè)荔枝果肉中游離植物甾醇含量。

高效液相色譜；二極管陣列檢測(cè)器；交替三線性分解；二階校正；植物甾醇

植物甾醇是果蔬中的生物活性物質(zhì)，進(jìn)入人體后可降低體內(nèi)膽固醇含量［1］。文獻(xiàn)報(bào)道有多種檢測(cè)植物甾醇的方法，如洋地黃皂苷沉淀法［2］，植物甾醇經(jīng)酶催化氧化后的比色法［3］、薄層色譜法［4］、分光光度法［5］、紅外光譜法［6］等，還有使用不同檢測(cè)器的氣相色譜法［7-8］和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［9-13］。但是沉淀法和比色法只能定量總植物甾醇，氣相色譜法在檢測(cè)植物甾醇前需要衍生化處理，質(zhì)譜定量中植物甾醇信號(hào)較弱。因此植物甾醇定量分析首選HPLC法。

按常規(guī)HPLC法，配合相應(yīng)的提取技術(shù)及前處理方法［14-17］，雖能得到比較滿意的結(jié)果。但植物甾醇常作為細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分和脂質(zhì)存在于植物細(xì)胞，有的以游離態(tài)存在，有的與糖類、脂肪酸等結(jié)合以結(jié)合態(tài)存在，如甾醇酯、甾苷和乙?；捃盏龋?8］，已發(fā)現(xiàn)的植物甾醇超過(guò)250 種［19］。最具代表性的和含量較高的植物甾醇有菜油甾醇、膽甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，而麥角甾醇則常存在于發(fā)霉的植物中［19］。植物甾醇是分子結(jié)構(gòu)帶有四環(huán)環(huán)戊二烯［α］的菲環(huán)和在第17個(gè)碳原子上有一條柔性長(zhǎng)鏈的類固醇化合物及其衍生物［20］，不同植物甾醇結(jié)構(gòu)相似（圖1），因而常規(guī)色譜分析中要達(dá)到基線分離需要足夠長(zhǎng)的洗脫時(shí)間；并且果蔬為復(fù)雜體系，檢測(cè)前需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，盡量去除干擾，以求響應(yīng)信號(hào)的簡(jiǎn)單化。因此，需要對(duì)常規(guī)LC方法進(jìn)行改進(jìn)。

圖 1　游離甾醇化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Chemical structures of free phytosterols

交替三線性分解（a l t e r n a t i n g t r i-l i n e a r decomposition，ATLD）算法利用基于切尾奇異值分解的Moore-Penrose廣義逆計(jì)算和交替迭代來(lái)進(jìn)行三線性數(shù)據(jù)分解，使損失函數(shù)即殘差陣元素的平方和達(dá)到極小值，詳見參考文獻(xiàn)［21］。二階校正方法以“數(shù)學(xué)分離”來(lái)部分代替或強(qiáng)化“理化分離”，在有未知干擾物和背景條件下實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系中目標(biāo)分析組分的快速有效分離定量，定量條件不要求達(dá)到基線分離，洗脫時(shí)間縮短。

本實(shí)驗(yàn)以荔枝果肉為檢測(cè)對(duì)象，利用HPLC-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-diode array detector，HPLC-DAD）結(jié)合基于ATLD算法的二階校正方法，使預(yù)處理簡(jiǎn)單快速，并允許部分色譜峰重疊，簡(jiǎn)化測(cè)量步驟并節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，從而建立起一種快速、穩(wěn)定的植物甾醇分析方法。結(jié)果顯示，其預(yù)處理簡(jiǎn)單，單次樣本測(cè)試所耗時(shí)間較短，可作為快速定量植物甾醇的可選擇方法。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

荔枝市購(gòu)，經(jīng)本校植物學(xué)教師鑒定為‘蘭竹’、‘烏葉’2 個(gè)品種。

菜油甾醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）百靈威科技有限公司；硫酸、乙醇、正己烷、特丁基對(duì)苯二酚、氫氧化鈉（均為分析純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

FW100高能粉碎機(jī)天津泰斯特儀器有限公司；101-A型數(shù)顯式電熱恒溫干燥箱上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；英展ALH-3天平上海英展機(jī)電企業(yè)有限公司；BLST-500Q球形脂肪抽出器上海比朗儀器有限公司；UGC-12C旋轉(zhuǎn)式水浴氮吹儀北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；RE52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；超聲波清洗機(jī)廣州邦潔超聲波設(shè)備有限公司；1100 HPLC儀（配有G1311A四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1322A在線脫氣機(jī)、G1316柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測(cè)器）安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品配制

菜油甾醇（0.5 mg/mL）、膽固醇（1.0 mg/mL）、豆甾醇（0.5 mg/mL）、β-谷甾醇（1.0 mg/mL）和麥角甾醇（1.0 mg/mL）溶于甲醇中配成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，置于冰箱－20 ℃保存。在使用之前取出放至室溫，而后稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液。

1.3.2荔枝果肉樣品中植物甾醇提取

荔枝果肉樣品中植物甾醇提取及預(yù)處理程序參考文獻(xiàn)［22］。荔枝去殼去核后，稱質(zhì)量，將果肉洗凈用濾紙擦干，將其切成片狀。在105 ℃條件下烘至恒質(zhì)量，將荔枝果肉放入粉碎機(jī)內(nèi)攪碎成顆粒狀，得到荔枝果肉干品，放入干燥器中保存。用天平準(zhǔn)確稱量10.00 g荔枝果肉粉，折好濾紙?zhí)缀蠓湃耄侔惭b索氏提取器，加入提取溶劑正己烷至圓底燒瓶，將荔枝果肉粉中的粗脂肪提取出來(lái)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓揮盡得到的粗脂肪中的溶劑后，于圓底燒瓶中加入10 mL鹽酸的乙醇溶液，安裝回流裝置于80 ℃水浴中加熱1 h，每隔10 min振蕩圓底燒瓶一次至回流結(jié)束，結(jié)束后冷卻至室溫，再加入氫氧化鉀的乙醇溶液20 mL，再安裝回流裝置于70 ℃水浴中加熱1 h，每隔10 min振蕩圓底燒瓶一次至回流結(jié)束，結(jié)束后冷卻至室溫。

冷卻至室溫后加入100 mL水和正己烷，攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中萃取3～4 次，合并萃取液，將多次實(shí)驗(yàn)（共100.00 g荔枝果肉粉）所得的萃取液集中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除正己烷后濃縮得甾醇粗品，用甲醇溶解定容至10 mL，得到檢測(cè)樣品。

1.3.3校正樣品配制

該方法的組內(nèi)精密度（可重復(fù)性）通過(guò)測(cè)定單點(diǎn)質(zhì)量濃度（160 μg/mL）來(lái)獲得，檢測(cè)6 次取其平均值，并獲得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即可確認(rèn)色譜條件的系統(tǒng)精密度。所配校正樣的質(zhì)量濃度范圍見表1。

表1　校正樣質(zhì)量濃度Taabbllee 11 　　PPhhyyttoosstteerrooll ccoonntteennttss ooff ccaalliibbrraattiioonn ssaammpplleessμg/mL

1.3.4加標(biāo)實(shí)際樣品配制

樣品加入標(biāo)準(zhǔn)品后，其后樣品提取及預(yù)處理程序同1.3.2節(jié)。方法的準(zhǔn)確度通過(guò)計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率來(lái)確定。

1.3.5色譜條件

色譜柱：島津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（95∶5，V/V）溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)190～340 nm；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。

2　　結(jié)果與分析

2.1色譜分離條件的優(yōu)化

圖2　 混合植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)HPLC色譜圖Fig.2　　HPLC profi les of mixed phytosterol standard materials

植物甾醇是極性非常弱的小分子化合物，在反相色譜柱上有很強(qiáng)的保留性。因此植物甾醇需要高濃度的有機(jī)溶劑來(lái)降低其在色譜柱上的保留性來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。為了得到較好的分離效果，選擇波長(zhǎng)210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)分析柱和流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化，5 種植物甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜結(jié)果如圖2所示。在所采用的HPLC色譜條件下，麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的保留時(shí)間分別為10.30、13.10、14.79、15.16、17.13 min，分析時(shí)間適中。由于不同植物甾醇分子結(jié)構(gòu)極其相似，菜油甾醇和豆甾醇色譜峰出現(xiàn)重疊，未能實(shí)現(xiàn)基線分離。如用常規(guī)LC法來(lái)定量，會(huì)因?yàn)樽V峰重疊及未知干擾的影響使得各組分的保留時(shí)間及含量出現(xiàn)偏差。因此需要對(duì)色譜峰進(jìn)行分段解析。

分段解析主要針對(duì)菜油甾醇和豆甾醇重疊部分進(jìn)行，利用基于三線性分解的二階校正方法所得到的純光譜數(shù)據(jù)及純色譜數(shù)據(jù)分別繪圖，再與標(biāo) 準(zhǔn)品在相同條件下測(cè)得的光譜和色譜圖形進(jìn)行對(duì)比，并以相應(yīng)譜圖的重合程度作為定性依據(jù)，得到更直觀的定性結(jié)果。再根據(jù)標(biāo)樣質(zhì)量濃度進(jìn)行定量分析，得到預(yù)測(cè)樣含量，并以加標(biāo)回收率及算法品質(zhì)因子來(lái)驗(yàn)證和評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)所采用的方法。

實(shí)際樣、加標(biāo)實(shí)際樣及校正樣的保留時(shí)間在14.4～15.8 min之間的色譜對(duì)照?qǐng)D如圖3所示。

圖 3　　實(shí)際樣、加標(biāo)實(shí)際樣及校正樣的色譜對(duì)照?qǐng)DFig.3　　Comparative chromatographic profi les of spiked real sample，real sample and calibration sample

2.2定性分析

圖 4　　解析出的譜圖與真實(shí)譜圖對(duì)比Fig.4　　Comparison between resolved profi les and actual profi les

前段數(shù)據(jù)包含2 個(gè)目標(biāo)分析組分，各貢獻(xiàn)一個(gè)因子，其余信號(hào)包括背景、噪聲干擾等提供一個(gè)因子，即選取的解析組分?jǐn)?shù)為3；后段數(shù)據(jù)包含一個(gè)目標(biāo)分析組分，其余信號(hào)提供一個(gè)因子，即選取的解析組分?jǐn)?shù)為2。ATLD算法在相應(yīng)組分?jǐn)?shù)條件下，解析HPLC-DAD得到的矩陣數(shù)據(jù)所構(gòu)成的三維數(shù)陣，解析出的圖譜與由校正樣解析出的標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的對(duì)照?qǐng)D如圖4所示。算法解析出的色譜、光譜圖的輪廓與對(duì)照品的色譜、光譜圖分別重合較好，說(shuō)明從色譜、光譜2 個(gè)角度上都證明了實(shí)際樣中菜油甾醇和豆甾醇的存在。

2.3定量分析

由ATLD算法分解所得到的相對(duì)濃度矩陣對(duì)照標(biāo)樣含量進(jìn)行后續(xù)回歸處理就能夠?qū)崿F(xiàn)定量預(yù)測(cè)。本方法得出的實(shí)際樣中菜油甾醇和豆甾醇的預(yù)測(cè)含量如表2所示。

表2　ATLD算法分辨獲得的實(shí)際樣品中菜油甾醇和豆甾醇的含量TTaabbllee 22 　　RReessoollvveedd ccoonntteennttss ooff ccaammppeesstteerrooll aanndd ssttiiggmmaasstteerrooll iinn real samples using ATLLDD

對(duì)算法的評(píng)價(jià)用到的品質(zhì)因子計(jì)算和純分析物信號(hào)密切相關(guān)，包括：靈敏度、選擇性、檢測(cè)限及與預(yù)測(cè)精密度相關(guān)的預(yù)測(cè)均方差等［21］。計(jì)算的各品質(zhì)因子見表3。加標(biāo)回收率的計(jì)算結(jié)果見表4。

表 3 ATLD算法品質(zhì)因子Taabbllee 33 　　FFiigguurreess ooff mmeerriitt ooff tthhee pprrooppoosseedd mmeetthhoodd uussiinngg AATTLLDD

表 4　加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果TTaabbllee 44 　　RReeccoovveerriieess ooff pphhyyttoosstteerroollss ffrroomm ssppiikkeedd lliittcchhii ppuullpp

由表4可知，菜油甾醇和豆甾醇的加標(biāo)回收率平均值分別為：（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%，加標(biāo)回收率小于100%。提取植物甾醇過(guò)程中，受熱會(huì)使植物甾醇分子雙鍵斷裂，而導(dǎo)致?lián)p失。通過(guò)查表可得到t-檢驗(yàn)的t值，t（6，0.10）=1.940。由t-檢驗(yàn)公式計(jì)算得到的t值分別為0.784、0.946，它們均小于t（6，0.10）值。以上結(jié)果表明二階校正方法得到的結(jié)果是可靠的。

2.4分析方法的應(yīng)用

表5　荔枝果肉樣品中植物甾醇含量TTaabbllee 55 　　TThhee ccoonntteennttss ooff pphhyyttoosstteerrooll iinn lliittcchhii ppuullppμg/g

為驗(yàn)證所建立的植物甾醇定量分析方法，從荔枝樣品中提取、分離并檢測(cè)植物甾醇。樣品處理如上所述，每個(gè)樣品5 次平行。分析在最優(yōu)條件下進(jìn)行。所測(cè)得的膽固醇、麥角甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的含量列于表5?？傊参镧薮己侩S荔枝品種不同有所區(qū)別，含量在102.4～113.2 μg/g之間。各種植 物甾醇中，‘蘭竹’和‘烏葉’荔枝果肉中膽甾醇含 量最高，分別為37.2 μg/g和43.1 μg/ g。β-谷甾醇含量最少，分別為15.3 μg/g和16.0 μg/g。菜油甾醇和豆甾醇含量差不多，分別為24.1 μg/g和27.4 μg/g，25.8 μg/g和26.7 μg/g。該檢測(cè)結(jié)果和氣相色譜分析荔枝中植物甾醇含量結(jié)果［23］相近。

3　　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)所建立的用HPLC-DAD結(jié)合基于ATLD算法的二階校正方法，能夠快速、可靠地對(duì)荔枝果肉中麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇定量分析。與傳統(tǒng)的LC法相比，該方法的優(yōu)勢(shì)在于使預(yù)處理簡(jiǎn)單化，色譜條件相對(duì)簡(jiǎn)單并允許部分色譜峰重疊及存在未知干 擾，測(cè)試所耗時(shí)間較短，試劑消耗量相對(duì)較少。

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Determination of Free Phytosterols in Litchi Pulp by HPLC-DAD Coupled with Second-Order Calibration Based on Alternating Trilinear Decomposition

XIANG Leiwen1， CHEN Guotai1， WENG Jiamin1， CHEN Wentao1， WANG Shaoyun2，*
（1. School of Ocean Science and Biochemistry Engineering， Fuqing Branch of Fujian Normal University， Fuqing350300， China；2. College of Biological Science and Engineering， Fuzhou University， Fuzhou350108， China）

A rapid method to quantify free phytosterols in litchi pulp was established with high performance liquid chromatography with diode array detection （HPLC-DAD） coupled with second-order calibration method based on alternating trilinear decomposition （ATLD） algorithm. The chromatographic conditions were simplifi ed by applying secondorder calibration method. The mobile phase was 95% aqueous acetonitrile （V/V） at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The injection volume was 20.0 μL. The temperature of inertsil ODS-SP （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） column was set at 30 ℃. The detection wavelengths were 190-340 nm. The average spiked recoveries of campesterol and stigmasterol in litchi pulp were （95.25 ± 0.78）% and （96.83 ± 1.01）%， respectively. The pulp of “Lanzhu” and “Wuye” litchi was detected to contain 24.1 and 27.4 μg/g campesterol， and 25.8 and 26.7 μg/g stigmasterol， respectively. The newly established method is simple， accurate， highly sensitive and reliable， and can be used to determine free phytosterols in litchi pulp.

high performance liquid chromatography （HPLC）； diode array detector （DAD）； alternating trilinear decomposition （ATLD）； second-order calibration； phytosterols

TS207.3

A

1002-6630（2015）24-0172-05

10.7506/spkx1002-6630-201524031

2015-06-12

福建省省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科“食品科學(xué)與工程”建設(shè)項(xiàng)目（閩教高［2012］48號(hào)）；福建省區(qū)域科技重大項(xiàng)目（ 2014N3005）

項(xiàng)雷文（1975—），男，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物綜合利用，生物大分子分離與表征，食品中美拉德反應(yīng)研究。E-mail：xiangleiwen@163.com

汪少蕓（1972—），女，教授，博士，主要從事食品化學(xué)、生物活性蛋白質(zhì)、酶和多肽及食品生物技術(shù)研究。E-mail：shywang@fzu.edu.cn