龐榮清，王強，石琳琳，楊建勇，何潔，朱向情，阮光萍，朱光旭，潘興華

臍帶間充質(zhì)干細胞對體外外周血單核細胞的影響

龐榮清，王強，石琳琳，楊建勇，何潔，朱向情，阮光萍，朱光旭，潘興華

目的觀察臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSC)對體外外周血單核細胞的影響。方法分離人UC-MSC和外周血單核細胞，流式分析技術(shù)鑒定單核細胞CD45和CD3的表達率；UC-MSC和單核細胞按不同比例共培養(yǎng)72 h，采用免疫熒光染色和ELISA方法檢測γ干擾素(IFN-γ)在細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清的表達。結(jié)果采用含10%血清的DMEM/F12可以從新鮮臍帶分離到UC-MSC，密度梯度離心法可以從外周血中分離到單核細胞，CD45陽性率為89.4%，CD3陽性率為80.7%?？稍贑D3/CD28刺激培養(yǎng)的單核細胞檢測到IFN-γ的表達，1∶10和1∶20共培養(yǎng)上清IFN-γ的含量顯著低于僅有單核細胞的對照組（P＜0.01）。結(jié)論UC-MSC的存在可以影響IFN-γ在單核細胞的表達，這種影響與兩種細胞的比例有關(guān)。

臍帶；間充質(zhì)干細胞；單核細胞；共培養(yǎng)；γ干擾素；影響

間充質(zhì)干細胞不表達MHC-Ⅱ、CD40和CD80等共刺激分子[1-2]，可以抑制淋巴細胞的增殖反應(yīng)[3]，這些特殊的生物學特性奠定了間充質(zhì)干細胞在自身免疫性疾病治療中可能存在潛在的應(yīng)用價值[4]。γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）在自身免疫性疾病的病理機制中起著重要作用[5]。本實驗以臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)和外周血單核細胞共培養(yǎng)體系為研究對象，觀察了UC-MSC對培養(yǎng)上清中IFN-γ的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及器材DMEM/F12培養(yǎng)基、新生牛血清和trypsin-EDTA均為Invitrogen公司生產(chǎn)；IFN-γ檢測試劑盒為聯(lián)科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；一抗mouse-anti-human IFN-γ、二抗FITC-goat-anti-mouse IgG以及流式抗體CD45和CD3均為Santa Cruz公司生產(chǎn)；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡為NIKON公司產(chǎn)品，流式細胞儀為BD公司生產(chǎn)。

1.2 UC-MSC及外周血單核細胞的制備按照本課題組建立的方法[6]分離擴增hUC-MSC，即采集健康分娩的人胎兒臍帶，無菌條件下剪碎并轉(zhuǎn)移至含10%血清的DMDM/F12中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長增殖情況，當細胞生長至90%融合時，胰酶消化傳代培養(yǎng)，第3代UC-MSC用于體外共培養(yǎng)實驗研究。采集健康志愿者外周血，密度梯度離心法分離外周血單核細胞，離心漂洗后，采用流式細胞技術(shù)分析鑒定細胞。

1.3 UC-MSC與外周血單核細胞共培養(yǎng)實驗參照文獻[7]報道方法，收集UC-MSC用含10%血清的DMDM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×104/ml，6孔板每孔加入1ml的UC-MSC混懸液，靜置培養(yǎng)4 h使其貼壁生長。收集外周血單核細胞用含10%血清的DMDM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105/ml。吸棄6孔板中UC-MSC的培養(yǎng)液，按照1∶5、1∶10和1∶20的比例，即依次分別往貼壁生長的UC-MSC培養(yǎng)孔中加入單核細胞懸液0.5、1和2ml，再用含10%血清的DMDM/F12培養(yǎng)液補充至3 ml/孔，最后加入CD3/CD28刺激單核細胞增殖生長。以未加UC-MSC的單核細胞孔作為對照。共培養(yǎng)72 h后，收集細胞培養(yǎng)上清測定IFN-γ的含量，收集對照孔中的單核細胞用于免疫熒光染色分析。

1.4 流式細胞技術(shù)分析參照本課題組建立的技術(shù)方法[6]，密度梯度離心法獲得的細胞加入流式抗體CD45和CD3室溫條件下孵育30 min，漂洗后用流式細胞儀檢測CD45和CD3的陽性率。

1.5 ELISA檢測分析按照試劑盒說明書完成檢測分析，即吸取50μl培養(yǎng)上清加到96孔板中孵育3 h，漂洗后加入生物素標記的IFN-γ抗體孵育30min，漂洗后加入streptavidin-HRP孵育30min，最后加入底物顯色，30min之內(nèi)用酶標儀測定光密度值。

1.6 免疫染色分析將單核細胞固定在載玻片上，用0.5%Triton X-100處理10 min，漂洗后加入山羊血清或含3%H2O2的封閉液室溫條件下作用10 min，滴加一抗mouse-anti-human IFN-γ，4℃孵育10 h，漂洗后，滴加二抗FITC-rabbit-anti-goat IgG于室溫條件下孵育30 min，再滴加DAPI孵育5min，漂洗后熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 UC-MSC的培養(yǎng)運用不剝離血管組織、不用酶消化的組織貼塊培養(yǎng)法，采用含10%血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，可以從人臍帶中分離到具有典型特征的UC-MSC，表現(xiàn)為呈旋渦狀貼壁生長，具有成纖維細胞樣的形態(tài)特征（圖1）。

圖1 UC-MSC的形態(tài)特征

2.2 外周血單核細胞的分離和鑒定通過密度梯度離心可以將外周血分離為明顯的4層，取位于中間位置的白膜層細胞，離心漂洗后，采用流式細胞技術(shù)鑒定CD45和CD3的陽性率。結(jié)果顯示，獲得的細胞CD45陽性率達89.4%，CD3的陽性率達80.7%（圖2）。

圖2 外周血單核細胞的流式分析

2.3 IFN-γ的表達采用免疫熒光染色法，可以檢測到CD3/CD28刺激培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h的單核細胞陽性表達IFN-γ（圖3）。

圖3 激活培養(yǎng)的外周血單核細胞表達IFN-γ的免疫染色

2.4 共培養(yǎng)上清IFN-γ的含量分析隨著單核細胞數(shù)量的增加，UC-MSC與單核細胞共培養(yǎng)體系上清中IFN-γ的含量大幅增加，而UC-MSC的存在可以降低共培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，1∶10以上比例UC-MSC的效果最顯著（表1）。

表1 不同比例UC -MSC和單核細胞共培養(yǎng)上清l FN-γ含量

3 討論

從臍帶中分離UC-MSC屬于變廢為寶的環(huán)保行為，不涉及倫理道德問題，取材方便，可以在短時間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的細胞，而且UC-MSC增殖分化能力強，不受供體年齡的限制，目前已經(jīng)成為干細胞研究的熱點。本研究按照我們先前已經(jīng)建立的技術(shù)方法[6]，成功從臍帶組織中分離到了UC-MSC；采用密度梯度離心法，成功從外周血分離到了單核細胞，流式細胞技術(shù)分析顯示細胞CD45陽性率達89.4%，CD3的陽性率達80.7%，與文獻報道[7]的純化T細胞95%、CD14+細胞91%的結(jié)果尚有差距，說明通過密度梯度離心法獲得的細胞是混合細胞。如果UC-MSC用于臨床治療，輸入到血管后，必定是直接接觸血液里的混合細胞，因此，本研究獲得混合細胞與UC-MSC接觸培養(yǎng)的模式正好模擬了臨床治療的情形，本研究結(jié)果具有臨床指導(dǎo)意義。

IFN-γ屬于分泌性表達蛋白，本研究采用ELISA法在培養(yǎng)上清中均檢測到了IFN-γ的存在，但隨著單核細胞數(shù)量增多，IFN-γ的含量大幅增長，表明在本研究建立的培養(yǎng)體系條件下，單核細胞分泌IFN-γ的狀態(tài)很好，經(jīng)體外CD3/CD28刺激培養(yǎng)的外周血單核細胞表達IFN-γ，得到免疫熒光染色分析證實。UC-MSC的存在可以顯著降低共培養(yǎng)上清中IFN-γ的含量，但UC-MSC與單核細胞之間的比例在1∶10和1∶20時抑制效果明顯增加，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異，表明UC-MSC用于臨床治療時輸注數(shù)量是個重要參數(shù)。最新研究表明[7]，MSC對T細胞的抑制在1∶5的比例條件下效果最好，為何本研究UC-MSC對共培養(yǎng)上清IFN-γ含量的影響最佳效果不在1∶5的比例條件下，很可能涉及兩方面的原因：一是體外研究結(jié)果與培養(yǎng)體系密切相關(guān)，細胞類型不同、刺激因素不同、培養(yǎng)體系環(huán)境不同都可能直接影響研究結(jié)果，況且T細胞的增殖很可能與IFN-γ的分泌不一致；二是共培養(yǎng)上清中IFN-γ的分泌是細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，已經(jīng)證明UC-MSC本身就會分泌多種細胞因子[8]，這些因子可能會通過細胞因子網(wǎng)絡(luò)影響單核細胞分泌IFN-γ。此外，本研究中UC-MSC與單核細胞直接接觸本身也會影響單核細胞的生物學特性，可見UC-MSC對單核細胞的影響涉及多種復(fù)雜機制，需要進一步深入研究。

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Effects of umbilical cordmesenchymal stem cells onmononuclear cells of peripheral blood in vitro

Pang Rongqing,Wang Qiang,Shi Linlin,Yang Jianyong,He Jie,Zhu Xiangqing,Ruan Guangping,Zhu Guangxu,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the effects of umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSC)on mononuclear cells of peripheral blood in vitro.Methods Human UC-MSC and mononuclear cells of peripheral blood were isolated.Flow cytometry was used to identify the expression rate of mononuclear cell CD45 and CD3.UC-MSC and mononuclear cells were co-cultured in different proportion for 72 h.Immunofluorescence staining and ELISA were used to detect the expression of interferon-γ(IFN-γ) within the cells and the cell culture supernatant.Results UC-MSC could be isolated from fresh umbilical cord by DMEM/F12 containing 10%serum.Mononuclear cells could be isolated from the peripheral blood by density gradient centrifugation.The positive rate of CD45 and CD3 was 89.4%and 80.7%,respectively.The expression of IFN-γwas detected in CD3/CD28-stimulatedmononuclear cells.The IFN-γcontent in the co-cultured supernatant in the proportion of 1∶10 and 1∶20 was significantly lower than that in the control group with onlymononuclear cells(P＜0.01).Conclusion The presence of UC-MSC can affect the expression of IFN-γinmononuclear cells,and the effects are related to the proportion of UC-MSC and mononuclear cells.

umbilical cord;mesenchymal stem cell;mononuclear cell;co-culture;interferon-γ;effect

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0820-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.003

2015-03-26）

云南省基金項目(2011HB050,2013DA004,2013CA005)；成都軍區(qū)基金項目（2012WJ003)；國家自然科學基金項目（31172170）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心,干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,云南省細胞治療技術(shù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室,云南省干細胞工程實驗室

潘興華，電話:0871-64774773；E-mail:xinghuapang@ aliyun.com