劉 斌 高建東 劉 清

肝癌細(xì)胞株中VEGFR活化檢測(cè)及臨床意義

劉 斌 高建東 劉 清

目的 探討血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)活化檢測(cè)在肺癌診治中的應(yīng)用價(jià)值。方法 應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)HepG2、QGY-7701、SMMC-7721、MHCC97-H和HCCLM3這5種人肝癌細(xì)胞株的VEGFR表達(dá)及活化前后的含量變化。結(jié)果 5種人肝癌細(xì)胞株的VEGFR均呈陽(yáng)性表達(dá)，活化后鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist含量顯著高于活化前，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 人肝細(xì)胞癌組織中存在VEGFR表達(dá)，可以作為肝癌發(fā)生發(fā)展的一種重要的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo), VEGFR活化促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移，鋅指轉(zhuǎn)錄因子是干預(yù)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；肝癌細(xì)胞；活化檢測(cè)；臨床診斷

由于血管生成能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，研究[1-2]表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為一種重要的刺激因子，在腫瘤血管的形成過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，而VEGF的2個(gè)特異性受體VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(KDR)活化都能體現(xiàn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)效應(yīng)。肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是含血管最豐富的一種的惡性腫瘤，其VEGF表達(dá)必然能提示腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移狀況[3]。為探尋肝癌基因治療中最有效的作用靶點(diǎn)，本研究進(jìn)行肝癌細(xì)胞株的VEGFR蛋白含量及活化前后Snail、Slug、Twist蛋白表達(dá)變化的檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 5株人肝癌細(xì)胞株均購(gòu)自上海鑫閔生命科學(xué)有限公司，分別是上皮樣人肝癌細(xì)胞HepG2、QGY-7701和SMMC-7721 HHCC，高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞HCCLM3和MHCC97-H。細(xì)胞培養(yǎng)基RPM-1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，小牛血清購(gòu)自上海萬(wàn)疆生物技術(shù)有限公司，SDS-PAGE凝膠、蛋白上樣緩沖液、電泳液均購(gòu)自北京賽馳生物公司，兔抗人VEGFD多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，人VEGF檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海嵐派生物公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將5種待檢人肝癌細(xì)胞株置于含有10%小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的RPM-1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，孵箱溫度控制在37℃，飽和濕度5% CO，細(xì)胞長(zhǎng)至80%培養(yǎng)皿面積時(shí)，以0.125%胰酶消化1min，倒去胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，用單去污劑裂解液裂解細(xì)胞。

1.2.2 濃度測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞數(shù)為5×106/mL的細(xì)胞懸液，接種96孔板，加入含不同濃度的VEGF-B培養(yǎng)基。分別用MTT法，以VEGF-Bong/mL的吸光值進(jìn)行校正，確定VEGF-B濃度為lng/mL是適宜肝癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)[2]。

1.2.3 檢測(cè)蛋白 (1)電泳：蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，先以100℃沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白。然后冷卻到室溫后，把30μg蛋白樣品加入12.5%SDS凝膠加樣孔內(nèi)，用100V恒壓在SDSPAGE電泳液中電泳90～120min，至蛋白被適當(dāng)分離后即停止電泳。(2)轉(zhuǎn)膜：用Bio-Rad的標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置(電流為300～400mA)轉(zhuǎn)膜30～60min。(3)封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后將蛋白膜放置到Western洗滌液中，漂洗1～2min，真空泵吸盡洗滌液后加入Western封閉液，在室溫下封閉60min。(4)一抗孵育：將兔抗人VEGFD多克隆抗體以稀釋液按1∶400比例稀釋后，將蛋白樣品置入其中，在4℃溫度下孵育過(guò)夜。(5)二抗孵育：將羊抗兔IgG-HRP按1∶2000稀釋后在室溫或4℃溫度下，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)孵育60min。(6)蛋白檢測(cè)：使用BeyoECL Plus顯影，用凝膠成像系統(tǒng)掃描各條帶灰度值進(jìn)行半定量分析。以酶標(biāo)儀測(cè)吸光度似值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。計(jì)算出細(xì)胞上清中VEGFR濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)本組研究的數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGFR蛋白含量 5株人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中都檢測(cè)出VEGF蛋白，以HCCLM3含量最高，達(dá)到(741.5±42.8) pg/mL，其余依次為MHCC97-H、SMMC-7721和HepG2，含量分別為(636.4±25.1)、(582.6±18.7)和(540.8±19.2)pg/mL，QGY-7701含量最低，僅為(487.5±13.7)pg，其中，VEGFR-1(Flt-1)在HCCLM3、SMMC-7721、HepG2和MHCC97-H這4種人肝癌細(xì)胞株中都呈陽(yáng)性表達(dá)，VEGFR-2(KDR)在HCCLM3、QGY-7701、MHCC97-H和HepG2也呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性物質(zhì)分布在胞膜及胞漿上，為棕黃色。只有QGY-7701和SMMC-7721分別在Flt-1和KDR中為陰性表達(dá)。

2.2 肝癌細(xì)胞株中VEGFR活化前后鋅指轉(zhuǎn)錄因子含量變化 無(wú)論是Flt-11還是KDR，活化后鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist的含量前均顯著高于活化前(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5種肝癌細(xì)胞株VEGFR活化前后鋅指轉(zhuǎn)錄因子含量比較±s,pg/mL)

表1 5種肝癌細(xì)胞株VEGFR活化前后鋅指轉(zhuǎn)錄因子含量比較±s,pg/mL)

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由表1可以看出，5種肝癌細(xì)胞株的受體VEGFR話化后，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist的表達(dá)均較活化前明顯增加，提示VEGFR活化促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移，鋅指轉(zhuǎn)錄因子是干預(yù)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)。

3 討論

研究[2-4]證實(shí)，腫瘤在形成、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中，新生血管形成發(fā)揮了非常關(guān)鍵的重要作用，VEGFR不僅表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，而且在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等許多實(shí)體腫瘤細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)和不斷分泌時(shí)，VEGF含量也會(huì)顯著增加，這一特點(diǎn)在含血管最豐富的肝癌中最為突出，臨床檢測(cè)證實(shí)，幾乎所有肺癌患者血清的VEGF含量都顯著高于健康人群。目前，對(duì)肝癌細(xì)胞如何突破基底膜侵襲鄰近組織，并逐漸向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)理并不十分清楚，但新生血管生成直接受到血管生成因子調(diào)控，因VEGF具有促進(jìn)血管生成和增加血管通透性的功能，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管袢的形成，血管新生為腫瘤的生長(zhǎng)提供了血供，間質(zhì)為腫瘤生長(zhǎng)提供了適宜的環(huán)境，從而為肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件是必然的[5]。本研究對(duì)5種不同的肝癌細(xì)胞株進(jìn)行VEGFR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有肝癌細(xì)胞株都存在VEGFR表達(dá)，并且都集中在上皮樣HCC中，尤以高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞HCCLM3和MHCC97-H含量最高，雖然對(duì)其中的原理并不清楚，但足以證實(shí)HCC能分泌大量的血管生成因子，以VEGFR檢測(cè)來(lái)診斷肝癌的敏感性和特異性都顯著高于文獻(xiàn)[1]中報(bào)道的其它惡性腫瘤，因此，VEGFR表達(dá)可以作為肝癌發(fā)生發(fā)展的一種重要的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

在VEGF的2個(gè)特異性受體中，目前對(duì)VEGFR-1被激活能促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移的研究較多，但對(duì)VEGFR-2活化后是否也促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和遷移還存在爭(zhēng)議，且激活VEGFR在肝癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用的具體機(jī)制認(rèn)識(shí)也并不統(tǒng)一，其中VEGFR-1被認(rèn)為是一種激酶損傷的受體酪氨酸激酶，VEGFR-1能夠通過(guò)誘導(dǎo)EMT而促進(jìn)肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移，許多不同的細(xì)胞外刺激因子能啟動(dòng)EMT和相應(yīng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變已形成共識(shí)[5-6]。本研究發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist的表達(dá)在VEGFR-1和VEGFR-2活化后明顯上調(diào)，說(shuō)明VEGFR活化在肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮了很大作用，這正是由于VEGFR活化誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株發(fā)生EMT，從而增加癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，當(dāng)然指轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和Twist如何誘導(dǎo)EMT發(fā)生，Snail的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

治療HCC是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題，目前多以控制轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)作為提高效果的途徑。從這個(gè)意義上說(shuō)，了解肝癌細(xì)胞如何獲得侵襲轉(zhuǎn)移潛能有很大臨床實(shí)用價(jià)值。檢測(cè)VEGFR活化后的含量是為了抑制肝癌細(xì)胞的VEGF/VEGFR。一方面，肝癌中很可能存在VEGF自分泌作用途徑，通過(guò)抑制血管新生能抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]；另一方面，可將VEGFR作為肝癌治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，或通過(guò)構(gòu)建Src尋找VEGFR——EMT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為治療肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移尋找新的作用靶點(diǎn)，這可以為尋找肝癌的治療探尋一個(gè)新的思路[8]。

總之，VEGFR能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)，在肺癌新生血管的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，可以作為肝癌發(fā)生、發(fā)展和治療效果的一種重要?jiǎng)討B(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo),VEGFR活化促進(jìn)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移，鋅指轉(zhuǎn)錄因子是干預(yù)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)。VEGFR活化檢測(cè)對(duì)肺癌治療及預(yù)后所產(chǎn)生的作用還可進(jìn)一步研究和探討。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.19.007

寧夏回族自治區(qū)自然基金項(xiàng)目（NZ13154）

寧夏 750001 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院外科學(xué)研究室 (劉斌) 內(nèi)蒙古 750333 內(nèi)蒙古阿左旗吉蘭泰醫(yī)院內(nèi)科 (高建東) 750001 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肝膽外科 (劉清)

劉清 E-mail:LB221084@163.com