劉振峰 劉建英

PGD2調(diào)控TGF-β1/Smads在支氣管哮喘中的實(shí)驗(yàn)研究

劉振峰 劉建英

目的 觀察PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，利用其受體特異性抑制劑Laropiprant調(diào)控TGF-β1/Smads在支氣管哮喘中的研究。方法 根據(jù)Laropiprant的濃度將細(xì)胞分組，每組分別加入TGF-β2（2.5ng/mL）培養(yǎng)24h后用Laropiprant刺激24h，分別用PCR法、WB法檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1、smad3和smad4的表達(dá)。采用不同濃度的Laropiprant作用于細(xì)胞不同時(shí)間，通過MTT法檢測(cè)Laropiprant對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果 隨著Laropiprant的濃度增加，細(xì)胞中TGF-β1、smad3及smad4的mRNA和蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度的Laropiprant作用于細(xì)胞不同時(shí)間后，其抑制率隨濃度增高和作用時(shí)間增長呈下降趨勢(shì)。結(jié)論 L-929小鼠肺成纖維細(xì)胞的中PGD2-DP1的表達(dá)可能與TGF-β1/Smads的調(diào)節(jié)相關(guān)。Laropiprant作用于細(xì)胞后，其抑制率隨濃度增高和作用時(shí)間增長呈下降趨勢(shì)。

PGD2；Laropiprant L-929；TGF-β1/Smads；支氣管哮喘

支氣管哮喘是一種慢性非特異性炎性疾病，在疾病的發(fā)生進(jìn)展過程中，由于炎癥對(duì)氣道的持續(xù)性損傷和機(jī)體對(duì)損傷的修復(fù)性反應(yīng)而形成的新結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,即氣道重塑，其主要表現(xiàn)為氣道平滑肌和基底膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，炎性細(xì)胞浸潤和腺體增生肥大的結(jié)果是產(chǎn)生持續(xù)的氣道高反應(yīng)性和不可逆性氣道阻塞；是支氣管哮喘肺功能進(jìn)行性下降的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，亦是近年來支氣管哮喘研究的熱點(diǎn)、重點(diǎn)之一。因此，應(yīng)對(duì)氣道重塑的其發(fā)生機(jī)制，本研究將探討PGD2對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，利用其受體特異性抑制劑Laropiprant調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路，為進(jìn)一步探討氣道纖維化形成的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 材料 L-929小鼠肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞(第三軍醫(yī)大學(xué)提供)，TGF-β1細(xì)胞因子(Gibco公司，USA)，PCR試劑盒(大連寶生物公司)，II級(jí)雞卵清白蛋白（Sigma公司，美國）；PGD2受體多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗（CsT公司，美國），BCA蛋白定量試劑盒、PVDF膜（Piece公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T1688615-1997“醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第五部分:細(xì)胞毒性試驗(yàn)體外法”進(jìn)行。將凍存的L-929細(xì)胞復(fù)蘇后，將生長狀態(tài)良好的L-929細(xì)胞于實(shí)驗(yàn)前1d傳代，第2天用0.25%胰酶(pH為7.8)消化，用DMEM高糖培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次(1500r/min，8min)，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/個(gè)，鋪于96孔平底板中置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4h，待細(xì)胞貼壁后，即將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞按照時(shí)間梯度分為12h組、24h組、48h組、72h組，分別加入含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋試驗(yàn)藥物(各組Laropiprant均按0.3μmL、1μmL、3μmL、10μmL比例配置)，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，每孔加入100μL試液，每個(gè)稀釋度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5%CO2孵箱中孵育24h，加入5mg/mL MTT20μL/孔(每毫升PBS中溶解5mgMTT，經(jīng)0.22μL 濾膜濾過以除菌和去不溶物，低溫、避光保存)，37℃、%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后，用預(yù)溫的PBS清洗2遍，棄去上清，加入溶解液DMSO 100μL/孔，于微型振蕩器上振蕩5min，使結(jié)晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在波長490nm處測(cè)定各孔吸光度(OD) 值。根據(jù)測(cè)定的吸光度值計(jì)算其相對(duì)的細(xì)胞生長抑制率。同樣方法測(cè)量48h藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞生長抑率。抑制率的計(jì)算公式:抑制率(100%)=［(對(duì)照組的OD值-給藥組的OD值)/對(duì)照組的OD值］×100%。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長期的L-929細(xì)胞以5×104個(gè)/mL接種于25mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，接種24h，按Laropiprant濃度梯度將細(xì)胞分為1組（0.3μmL）、2組（1μmL）、3組（3μmL）、4組（10μmL）、5組（30μmL），每組分別加入TGF-β2（2.5ng/mL）[7]。引物序列:PGD2：上游5’-CGGAATTCATGGTCCACAGCATTCCGCTG-3’，下游5’-CGGGATCCCTAATTGATCCCGCTGCTCA-3’；TGF:上游5’-CCAGATCCTGTCCAAACTAAGG-3’，下游5’-CATGTTGCTCCACACTTGATTT-3’；smad3:上游5’-TGAACACCAAGTGCATTACCA-3’，下游5’-GGAGGTAGAACTGGCGTCTCT-3’；smad4:上游5’-ACATTGGATGGACGACTTCAG-3’，下游5’-TCAATTCCAGGTGAGACAACC-3’。細(xì)胞總RNA提取:加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h后加入適量的Trizol，將細(xì)胞收入EP管中。每個(gè)EP管中加入0.05μg/l氯仿0.2mL，加蓋，振搖15s，室溫靜置3min，12000r/min離心15min，吸取上清液移至另一EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10min，12000r/min離心15min，棄上清，加入75%乙醇1mL，7500r/min離心5min，棄上清，空氣中干燥5～10min，加入DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水30μL溶解RNA，-80℃保存。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:10×RNA PCR buffer 5μL，25mmol/L MgCl24μL，10mmol/L dNTP 1μL，Oligo dT50 pmol，Rnasin 20U，AMV 5U，cDNA 10μL，補(bǔ)加DEPC處理水至20μL。于熱循環(huán)儀中95℃預(yù)變性

5min，再進(jìn)行95℃變性1min、57℃退火1min、72℃延伸

1min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.2%糖凝膠電泳，HB染色后拍照。通過Potoshop 圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度。

1.2.3 Western blot檢測(cè)TGF量 提取總蛋白，BCA法測(cè)定濃度。按Laropiprant濃度梯度將細(xì)胞分為1組（0.3μmL）、2組（1μmL）、3組（3μmL）、4組（10μmL）、5組（30μmL），每組分別加入TGF-β2（2.5ng/mL）。以每孔40mg上樣，用lO的聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，與小鼠抗兔的GATA-3(1∶1000)和

13-actin(1∶1000)單克隆抗體孵育4℃過夜，洗膜后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠的IgG抗體(1:1000)孵育6h，用發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶，使用Gensnap凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。正態(tài)計(jì)量資料采用“x±s”表示；2組正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PGD2-DP1抑制后TGF-β1、smad3及smad4的信號(hào)改變 隨著加入Laropiprant的濃度增加，細(xì)胞TGF-β1、smad3以及smad4的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1～3。

圖1 TGF-β2刺激L-929細(xì)胞后使用Laropiprant抑制PGD2-DP1受體表達(dá)，使用PCR和WB法檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)

圖2 TGF-β2刺激L-929細(xì)胞后使用Laropiprant抑制PGD2-DP1受體表達(dá)，使用PCR和WB法檢測(cè)細(xì)胞Smad3的表達(dá)。

圖3 TGF-β2刺激L-929細(xì)胞后使用Laropiprant抑制PGD2-DP1受體表達(dá)，使用PCR和WB法檢測(cè)細(xì)胞smad4的表達(dá)。

2.2 Laropiprant抑制PGD2-DP1對(duì)小鼠肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 使用EXCEL統(tǒng)計(jì)軟件將酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)橐种坡蕡D標(biāo)。細(xì)胞抑制率隨濃度增高和作用時(shí)間增長呈下降趨勢(shì)，Laropiprant在濃度達(dá)到1μmol/L，作用時(shí)間在24～36h時(shí)，細(xì)胞生長抑制率明顯升高（見圖4）。

圖4 細(xì)胞活力曲線圖

3 討論

支氣管哮喘是由多種炎癥細(xì)胞和多種炎癥介質(zhì)參與的慢性氣道炎癥，受遺傳因素和環(huán)境因素的雙重影響[1]，且氣道炎癥與重塑在支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來關(guān)于氣道重構(gòu)的研究說法不一，而學(xué)者普遍認(rèn)為TGF-β1在氣道炎癥和纖維化中發(fā)揮了重要作用。TGF-β1能刺激氣道平滑肌細(xì)胞分裂與增殖，導(dǎo)致平滑肌增生和肥厚，促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成?型和ó型膠原,誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞合成?型膠原，參與并促進(jìn)氣道重塑的形成[2]。Smad蛋白是目前所知的惟一TGF-β1受體的胞內(nèi)激酶底物，TGF-β1導(dǎo)致氣道重塑的生物活性是通過Smad蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)的。使用ELISA法檢測(cè)穩(wěn)定期的支氣管哮喘哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1后發(fā)現(xiàn)，其含量顯著高于健康對(duì)照組，變應(yīng)原刺激24小時(shí)后的TGF-β1濃度更高[3]。本實(shí)驗(yàn)以小鼠L-929小鼠肺成纖維細(xì)胞細(xì)胞為研究對(duì)象，通過應(yīng)用TGF-β2刺激細(xì)胞產(chǎn)生PGD2，運(yùn)用RT-PCR和Western blot法來檢測(cè)TGF-β1、smad3和smad4的表達(dá)，結(jié)果提示：隨著PGD2的濃度增加，細(xì)胞TGF-β1、smad3和smad4的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這說明在小鼠氣道慢性炎癥過程中，PGD2受體可能對(duì)細(xì)胞TGF-β1、smad3和smad4的表達(dá)具有調(diào)控作用[4-5]，且在慢性氣道炎癥引起的氣道重構(gòu)中發(fā)揮了核心的作用[6-8]。但Vigola[9]上述研究證實(shí)的PGD2/DP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，不僅能抑制成纖維細(xì)胞的遷移，也可以調(diào)整成成纖維細(xì)胞介導(dǎo)前膠原纖維的收縮反應(yīng)，此結(jié)論提示了新的支氣管哮喘氣道重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制。

PGD2對(duì)哮喘免疫反應(yīng)的雙向調(diào)節(jié)能力，可作為炎癥介質(zhì)產(chǎn)生致炎作用。Murray[10]等人在支氣管哮喘患者在吸入塵螨后對(duì)其肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的PGD2的濃度可增加15倍。PGD2不僅誘導(dǎo)了支氣管收縮，并且促使支氣管收縮的效應(yīng)強(qiáng)于組胺30倍。在支氣管哮喘患者受到抗原刺激后，其氣道內(nèi)存在大量PGD2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：給予環(huán)氧合酶抑制劑后，可部分抑制速發(fā)性哮喘反應(yīng)的嚴(yán)重程度，證明了PGD2在慢性氣道炎癥中起到了調(diào)節(jié)作用。Kohyama[11]等人通過培養(yǎng)人胎兒肺成纖維細(xì)胞（HFL-1）進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，證明了PGD2不僅抑制HFL-1對(duì)人纖連蛋白（HFN）的趨化作用的因子，而且還可以減緩成纖維細(xì)胞的遷移。以上都是通過Ca2+依賴PKA信號(hào)通路來發(fā)揮作用的[12]。這種作用體現(xiàn)在氣道炎癥損傷后修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞過度聚集太少不利于損傷的修復(fù)，而成纖維細(xì)胞過多則會(huì)發(fā)生變形，使組織喪失的功能結(jié)構(gòu)。

綜上所述，L-929小鼠肺成纖維細(xì)胞中的PGD2-DP1受體可能與TGF-β1/Smads的調(diào)節(jié)相關(guān)，兩者之間的關(guān)系為正相關(guān)，這與相關(guān)報(bào)道一致，但是本實(shí)驗(yàn)仍未涉及其具體調(diào)控機(jī)制的研究。此外，在活體復(fù)雜的環(huán)境中，PGD2對(duì)TGF-β1/Smads的調(diào)控規(guī)律也有待進(jìn)一步研究。

[1] Bone HG,McClung MR,Roux C,et al.Odanacatib,a cathepsin-Kinhibitor for osteoporosis:a two-year study in postmenopausal women with low bone density[J].J Bone Miner Res,2010,25(5):937-947.

[2] Xie S,Sukkar MB,Issa R,et al.Mechanisms of induction of airway smooth muscle hyperplasia by transforming growth factor-beta[J].Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol,2007,293:L245-L253.

[3] Logue CA,Peak IR,Beacham IR.Facile construction of unmarked deletion mutants in Burkholderia pseudomallei using sacB counter-selection in sucrose-resistant and sucrose-sensitive isolates[J].J Microbiol Methods，2009,76:320-323.

[4] Matsumoto K,Yokote H,Arao T,et al.N-glycan fucosylation of epidermal growth factor receptor modulates receptor activity and sensitivity to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor[J].Cancer Sci，2009,99:1611-1617.

[5] Takahashi M,Kuroki Y,Ohtsubo K,et al.Core fucose and bisecting GlcNAc,the direct modifiers of the N-glycan core:their functions and target proteins[J].Carbohydr Res,2009,344:1387-1390.

[6] Murata T,Aritake K,Tsubosaka Y,et al.Anti-inflammatory role of PGD2 in acute lung inflammation and therapeutic application of its signal enhancement[J].Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(13):5205-5210.

[7] Goldman R,Ressom HW,Varghese RS,et al.Detection of hepatocellular carcinoma using,glycomic analysis[J].Clin Cancer Res,2009,15:1808-1813.

[8] Newsom-Davis TE,Wang D,Steinman L,et al.Enhanced immune recognition of cryptic glycan markers in human tumors[J].Cancer Res,2009,69:2018-2025.

[9] Schwartz Jules I,Liu Fang,Wang Ying-Hong,et al.Effect of Laropiprant,a PGD2 Receptor 1 Antagonist,on Estradiol and Norgestimate Pharmacokinetics After Oral Contraceptive Administration in Women[J]. American Journal of Therapeutics,2009,16(6):487-495.

[10] Song WL,Stubbe J,Ricciotti E,et al.Niacin and biosynthesis of PGD2 by platelet COX-1 in mice and humans[J].The Journal Of Clinical Investigati on,2012,112(4):1459-1468.

[11] Sedej Miriam,Platzer Wolfgang,Heinemann ákos,et al.Cross-talk of PGD2 receptors:the DP receptor modulates signaling and trafficking of CRTH2[J].BMC Pharmacology,2010,10(S):A7.

[12] Deng H,Hershenson MB,Lei J,et al.Pulmonary artery smooth muscle hypertrophy:roles of glycogen synthase kinase-3beta and p70 ribosomal S6 kinase[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2010,298(6):L793-803.

Objective To explorer PGD2 biological characteristics in mice lung fibroblasts cell by Laropiprant is a specific inhibitor of PGD2receptor regulation of TGF-β1/Smads signaling pathway.Provide further basis research to explore the molecular mechanisms of airway fibrosis. Methods The cells divided by Laropiprant concentration 1 (0.3μmol) group, 2 (1μmol) group, 3 (3μmol) group, 4 (10μmol) group, 5 (30μmol) and the control group. Each group were added TGF-β2(2.5ng / mL) were cultured for 24 hours after stimulation with the corresponding concentrations of Laropiprant 24h, TGF-β1smad3and smad4expression were detected by PCR and WB, respectively. A randomized approach, using different concentrations of Laropiprant (0.3μmol, 1μmol, 3μmol, 10μmol, 30μmol)acts on cells at different times (12h, 24h, 48h, 72h, 96h) by MTT assay for cell growth Laropiprant inhibition.Results TGF-β1, smad3and smad4mRNA expression decreased with the addition of Laropiprant concentration increases, there was significant difference compared with the control group with (P＜0.05). TGF-β1, smad3and smad4protein expression decreased with the addition of Laropiprant concentration increases, there was significant difference compared with the control group with (P ＜0.05). Cell growth inhibition rate decreased with Laropiprant concentration increasing and cell culture time growth, Laropiprant in concentration 1μml, reaction time was 24 to 36h, the cell growth inhibition was significantly improved.Conclusion PGD2-DP1expression in L-929 mouse lung fibroblasts cell may be associated with TGF-β1/ Smads regulation.

PGD2; Laropiprant L-929; TGF-β1/Smads; Biological characteristics

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.2.002

貴州 563003 遵義市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 （劉振峰 劉建英）

劉建英 E-mail:ljy2317@126.com