劉銘，賈東升，趙江麗，溫春秀，崔施展，李榮喬，謝曉亮，*（.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊05005；.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊0500）

甘草廢渣中總黃酮提取工藝研究

劉銘1，賈東升1，趙江麗2，溫春秀1，崔施展1，李榮喬1，謝曉亮1，*
（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051；2.河北省藥品檢驗(yàn)研究院，河北石家莊050011）

摘要：優(yōu)化甘草廢渣中總黃酮的提取工藝。以甘草苷為對照品，采用比色法測定總黃酮含量，在單因素基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法以總黃酮提取得率（Y，%）為響應(yīng)值，以乙醇濃度（X1，%），提取時(shí)間（X2，min）、液料比（X3，mL/g）及提取次數(shù)（X4，次）為自變量，研究各自變量及各自變量間交互作用對總黃酮提取得率的影響，對3批甘草廢渣進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。研究結(jié)果表明甘草黃酮最佳提取工藝為：乙醇濃度為70%、提取時(shí)間120 min、液料比10∶1（mL/g）、提取次數(shù)2次，在優(yōu)化條件下對3批甘草廢渣進(jìn)行工藝驗(yàn)證，甘草黃酮提取得率為（2.4±0.34）%（n=3），與預(yù)測理論值2.39%接近。利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化得到的甘草廢渣總黃酮提取工藝參數(shù)可靠，方法簡便，預(yù)測性良好。

關(guān)鍵詞：甘草廢渣；響應(yīng)面；總黃酮

甘草為豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根和根莖，甘草主要成分為甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷類化合物和查爾酮、二氫黃酮等黃酮類化合物，具有補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，調(diào)和諸藥等功效[1-3]。新疆是我國最大的甘草產(chǎn)地和甘草初加工基地，新疆甘草品質(zhì)優(yōu)良，其供應(yīng)量約占全國甘草用量的50%。在甘草的利用過程中，甘草多用水提取，制備甘草酸、甘草次酸，提取完成后產(chǎn)生大量藥材廢渣，多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)將其作為廢棄物直接丟棄，不僅造成了浪費(fèi)資源還污染環(huán)境，簡單的水提無法使藥材中的黃酮類化合物充分轉(zhuǎn)移，甘草殘?jiān)腥源嬖诖罅奎S酮類物質(zhì)。研究表明甘草黃酮具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗?jié)?、抗抑郁、抗腫瘤、抗HIV等活性，廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[4-6]，具有廣泛的使用前景和較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本課題組研究了甘草廢渣總黃酮的提取工藝，為甘草廢渣的再次利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甘草廢渣（水提取后的藥渣干燥品）：新疆；甘草苷對照品（含量≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；氫氧化鉀（20140715，分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；甲醇（20140721，分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（20140102，分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；水為高純水；數(shù)控超聲提取機(jī)：濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司；電子天平（十萬分之一）：梅特勒托利多；752PC型紫外光可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備

取甘草苷對照品5 mg，精密稱定，甲醇定容至10 mL，配得0.5 mg/mL對照品母液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

取對照品溶液0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL甲醇定容至10 mL，即得系列對照品溶液。取系列對照品溶液1 mL，加入10%KOH溶液1 mL，靜置5 min，甲醇定容至10 mL，即得，在334 nm處測定吸光度，10%KOH溶液1 mL甲醇定容至10 mL作為對照[7]。吸光度A對溶液濃度C回歸得：Y=0.056X+0.022，r=0.999，甘草苷濃度在3 μg/mL～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取60%、70%、80%乙醇溶液作為提取溶劑，提取時(shí)間90、120、150 min，液料比8∶1、10∶1、12∶1（mL/g）及提取次數(shù)1、2、3次為自變量，甘草總黃酮提取得率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken響應(yīng)面法對甘草總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并且按最優(yōu)提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。因素水平見表1。

表1Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

2　結(jié)果與分析

2.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以甘草黃酮提取得率（Y，%）為因變量，選取乙醇濃度（X1，%）、提取時(shí)間（X2，min）、液料比（X3，mL/g）及提取次數(shù)（X4，次）為自變量，采用四因素三水平的Box-Benhnken響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化甘草黃酮提取得率（Y，%），試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Experimental design and corresponding results for response surface analysis

采用“Design expert 7.0”試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以因變量分別對各自變量擬合回歸方程及進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

對表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到甘草黃酮提取得率對所選4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表3　回歸方程中系數(shù)的顯著性及方差分析Table 3　Significance test of coefficient and analysis of variance for regression equation

對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理結(jié)果表明，方程的模型顯著（P< 0.01），說明模型有意義；失擬差不顯著（P>0.05），說明模型與試驗(yàn)值的差異較小，該模型擬合程度良好，可以用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。表3中一次項(xiàng)X1和X4水平均顯著（P<0.05）；交互項(xiàng)X1X2和X1X4水平顯著（P<0.05）；二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42水平均極顯著（P<0.01）。

2.2響應(yīng)面分析圖

考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比及提取次數(shù)對甘草黃酮提取得率的影響，各因素之間的交互作用對甘草黃酮提取得率影響見圖1。

4個(gè)因素水平選值合理，回歸模型存在最大值，最佳落點(diǎn)在試驗(yàn)考察的區(qū)域內(nèi)。由該模型預(yù)測得到的最佳提取工藝為：乙醇濃度為70.5%、提取時(shí)間為118 min、液料比為9.8∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證模型的可靠性，采用修正后的提取條件：乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為120 min、液料比為10∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次，平行試驗(yàn)3次。3次驗(yàn)證試驗(yàn)，甘草黃酮提取得率為（2.4±0.34）%，與理論預(yù)2.39%測值非常接近，證明該回歸模型可靠，可用于代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

圖1　各因素交互作用對甘草總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.1　Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on the yield of total fiavonoids

3　結(jié)論與討論

本研究采用Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化甘草廢渣中總黃酮提取工藝，通過單因素及響應(yīng)面法篩選出了較適提取工藝，乙醇濃度為70%、提取時(shí)間為120min、液料比為10∶1（mL/g）、提取次數(shù)為2次，甘草黃酮提取得率為2.4%。

甘草廢渣為甘草提取甘草酸后工業(yè)廢渣，其中含有大量黃酮類成分，主要為查耳酮及二氫黃酮，具有較強(qiáng)的抗氧化、消炎抑菌等藥理活性，被廣泛應(yīng)用于食品及化妝品領(lǐng)域[8]。我國甘草資源豐富，但由于過度的開采，造成甘草資源急劇減少，同時(shí)也造成生態(tài)環(huán)境的惡化，因此針對甘草廢渣的再利用的研究顯得尤為重要，甘草廢渣的再利用不僅緩解了甘草資源匱乏的局面，減少了甘草廢渣對環(huán)境的污染，同時(shí)利用甘草廢渣為原料制備甘草黃酮具有較大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)價(jià)值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.019

收稿日期：2015-10-22

基金項(xiàng)目：河北省農(nóng)林科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（A2015050101）；河北太行山區(qū)特色功能保健食品的開發(fā)研究（11231005D）；河北省中藥材產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目（11232025D）

作者簡介：劉銘（1976—），男（漢），副研究員，本科，主要從事中藥種植加工研究。

*通信作者：謝曉亮（1962—），男，研究員，博士，主要從事中藥資源、中藥加工研究。

Optimization of Extraction Parameters of Total Flavonoids from Licorice Residue

LIU Ming1，JIA Dong-sheng1，ZHAO Jiang-li2，WEN Chun-xiu1，CUI Shi-zhan1，LI Rong-qiao1，XIE Xiao-liang1，*
（1.Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Centre of Medicinal Plant Research，Shijiazhuang 050051，Hebei，China；2.Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，Hebei，China）

Abstract：Extraction parameters of total flavonoids from licorice residue was optimized by response surface method.The total flavonoids content was determined by colorimetric method.The effect ofethanol concentration，extraction time，the ratio of material to liquid ratio and extraction times was studied.The effect of each factor and interaction on the extraction rate of total flavonoids was studied.3 batches of licorice residue were used for validation test under the optimized conditions.Research results showed that thebest extraction parameters was：ethanol concentration 70%，extracting time 120 min，ratio of 10∶1（mL/g），extracting times of 2，the extraction rate of flavonoids was（2.4±0.34）%（n=3），the difference was little between 2.39%predictions.The extraction parameters of total flavonoids from licorice residue obtained by Box-Behnken response surface method were reliable，simple and convenient.

Key words：licorice residue；response surface；total flavonoids