林云萬 梁穎茹 賀 征 李 燕 張 旭 魏躍紅

由于廣譜抗菌藥物的廣泛使用及侵入性治療技術(shù)的不斷開展，鮑曼不動(dòng)桿菌近年來成為我國引起院內(nèi)感染的重要多重耐藥菌，被稱為革蘭氏陰性桿菌中的“MRSA”，尤其在重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)的檢出率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢。本實(shí)驗(yàn)通過PFGE方法對(duì)某院ICU分離的11株MDRAB進(jìn)行同源性分析，旨在了解MDRAB醫(yī)院內(nèi)感染的分子機(jī)制，明確感染源頭及感染途徑，為盡早發(fā)現(xiàn)及控制醫(yī)院感染和臨床防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 分離自某院ICU 5床和8床感染患者痰標(biāo)本2株，同期ICU環(huán)境中的床欄、記錄臺(tái)、儀器按鈕、電腦鍵盤、門把手和醫(yī)務(wù)人員手樣本分離出9株。

1.1.2 主要試劑 VITEK2－COMPACT全自動(dòng)微生物生化分析系統(tǒng)細(xì)菌鑒定卡及AST－GN09藥敏卡，藥敏卡包括氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林等19種臨床常用抗生素;PFGE使用膠為BIO－RAD公司的瓊脂糖膠;Tris、EDTA等生化試劑為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 VITEK2－COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng);Bio－rad CHEF Map－perTM脈沖場凝膠電泳儀、Bio－rad紫外線投射凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 使用VITEK2－COMPACT全自動(dòng)微生物生化分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定及抗菌藥物敏感試驗(yàn)(MIC法)，以大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制，藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果按CLSL2012標(biāo)準(zhǔn)判定[1]。

1.2.2 脈沖場凝膠電泳(PFGE) 將培養(yǎng)過夜的純菌落配制成細(xì)菌懸浮液，用低熔點(diǎn)瓊脂膠進(jìn)行包被，蛋白酶K消化24 h。限制性內(nèi)切酶ApaI37℃酶切24 h。用0.5×TBE緩沖液配制1%SeaKem Gold瓊脂糖膠，加熱溶解后冷卻至55℃，緩緩倒入模具中，放置30 min。電泳條件設(shè)置:電壓6V/cm，脈沖參數(shù)5～20 s，溫度14℃，夾角120°，電泳時(shí)間20 h。電流結(jié)束，EB染色后成像。PFGE結(jié)果判讀按美國疾病控制和預(yù)防中心TENOVER等[2]推薦的方法判讀，酶切后圖譜完全一致定為同一型，有1～3個(gè)條帶不同者為同一型的不同亞型，差異3個(gè)條帶以上者為另一型。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

11株MDRAB對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重，對(duì)左氟沙星的耐藥率最低(54.5%)，其次為哌拉西林/他唑巴坦(81.8%)，對(duì)其他17種抗菌藥物的耐藥率均很高(90.9% ～100%)，見表1。

表1 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)19種抗菌藥物的耐藥情況

數(shù)字1～10分別代表5床患者、5床床欄、5床儀器按鈕、8床患者、8床床欄、12床記錄臺(tái)、移動(dòng)推車、某護(hù)士手、公用電腦鼠標(biāo)、門把手、10床記錄臺(tái)分離的MDRAB。

2.2 PFGE同源性分析

采用PFGE對(duì)11株MDRAB進(jìn)行同源性分析的結(jié)果顯示，共分4個(gè)PFGE型，分別命名為A～D。其中A型包括5床感染患者、5床床欄、5床儀器按鈕、8床感染患者、8床床欄、12床記錄臺(tái)、移動(dòng)推車和某護(hù)士手分離株;公用電腦鼠標(biāo)分離株為B型;門把手分離株為C型;10床記錄臺(tái)分離株為D型。見圖1。

圖1 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌PFGE分型圖譜

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌由BEIJERINCK于1911年發(fā)現(xiàn)后，直到上世紀(jì)70年代，對(duì)絕大多數(shù)抗菌藥物都敏感，隨著臨床上廣譜抗生素的濫用和抗生素選擇性壓力的不斷增加，鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥情況日趨嚴(yán)重。11株MDRAB對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重，對(duì)青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、呋喃類耐藥率很高，絕大部分達(dá)到100%，達(dá)到一個(gè)很高的水平。鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥譜非常廣泛，具有多種耐藥機(jī)制:①產(chǎn)生多種β－內(nèi)酰胺酶，使β－內(nèi)酰胺藥物失去活性而耐藥。②細(xì)胞膜孔蛋白缺失、主動(dòng)外排系統(tǒng)編碼基因缺失，導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不足而耐藥。③可同時(shí)產(chǎn)生多種耐藥質(zhì)粒，導(dǎo)致對(duì)多種類型的抗菌藥物表現(xiàn)交叉耐藥和多藥耐藥的特點(diǎn)。④整合子的基因傳播能力、主動(dòng)外排機(jī)制介導(dǎo)以及細(xì)菌生物膜對(duì)抗菌藥物的阻擋也是MDRAB多藥耐藥性的重要原因[3－6]。正是由于鮑曼不動(dòng)桿菌具有上列耐藥機(jī)制，使其形成多重耐藥且耐藥性快速上升的原因所在，同時(shí)，也由于耐藥株更適應(yīng)于在抗生素廣泛使用環(huán)境下的選擇性生存，多重耐藥甚至泛耐藥菌株分離率不斷上升，容易導(dǎo)致醫(yī)院感染的暴發(fā)和流行。

MDRAB因其對(duì)抗菌藥物的高度耐藥常常導(dǎo)致臨床抗感染治療的失敗，MDRAB的水平傳播給醫(yī)院的感染控制工作帶來挑戰(zhàn)[7]。2009～2010 年中國 CHINET 細(xì)菌耐藥監(jiān)測資料[8－9]顯示:鮑曼不動(dòng)桿菌院內(nèi)感染已列第4位，成為僅次于銅綠假單胞菌的重要非發(fā)酵菌。因此，分析MDRAB的分子流行特征，檢測不同菌株間的同源相關(guān)性，對(duì)了解感染的源頭，探尋MDRAB在醫(yī)院內(nèi)的水平傳播途徑以及控制多重耐藥菌株的播散具有重要意義。PFGE以其重復(fù)性好，分辨力強(qiáng)而被譽(yù)為細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。本研究采用PFGE技術(shù)對(duì)11株MDRAB進(jìn)行基因分型，共分4個(gè)型，命名為A～D型。其中A型有8株菌，包括5床患者及床單元內(nèi)的床欄和儀器按鈕、8床患者及床欄、12床記錄臺(tái)、移動(dòng)推車、某護(hù)士手。從PFGE結(jié)果可知，5床患者與8床患者為同一基因型，結(jié)合臨床資料，8床患者為ICU長期住院病人，并感染有MDRAB，5床患者后入院并于一段時(shí)間后發(fā)生MDRAB院內(nèi)感染，同時(shí)，兩株菌對(duì)19種常用抗生素的耐藥表型完全一致，皆為耐藥，依此可判斷，5床患者與8床患者為同一株MDRAB引起的交叉感染，該院ICU存在A型克隆株的播散流行;ICU環(huán)境存在A型MDRAB的廣泛定值，特別是感染患者的床單元內(nèi)物品，諸如床欄、儀器按鈕等定值情況最為嚴(yán)重，同時(shí)ICU也存在B型、C型和D型菌株的定值;某護(hù)士手中分離出A型菌株，環(huán)境中MDRAB定值最廣泛的地方皆為手接觸頻繁的物品，說明手的接觸傳播在該菌的流行中起著不可忽視的作用，正因?yàn)槭值膫鞑プ饔?，克隆株進(jìn)一步在環(huán)境中擴(kuò)散定值，并引起院內(nèi)感染的發(fā)生，8床患者的MDRAB感染，極可能是受污染的醫(yī)務(wù)人員手接觸傳播所致。

綜上所述，該院ICU存在A型MDRAB克隆株的院內(nèi)感染，耐藥菌在環(huán)境物品表面的定值情況比較嚴(yán)重，需引起醫(yī)務(wù)工作者的高度重視。切斷耐藥株的傳播，ICU醫(yī)務(wù)人員應(yīng)迫切做好病房的消毒隔離，同時(shí)加強(qiáng)感染控制措施，如勤洗手、規(guī)范無菌操作、合理使用抗菌藥物等[10]。此外，院內(nèi)必須重視和開展細(xì)菌耐藥性監(jiān)測工作，進(jìn)行同源性分析，追蹤感染源，及時(shí)切斷耐藥克隆株的傳播，以避免院內(nèi)感染的大規(guī)模暴發(fā)。

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