于燕燕，杜　峰，王　娜（.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300308；.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作天津中心，天津300308）

食品中三聚氰胺的快速檢測(cè)方法

于燕燕1，杜峰2，王娜1
（1.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300308；2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作天津中心，天津300308）

摘要：三聚氰胺是一種廣泛用于塑料、造紙和肥料的化工原料，若添加到食品中并長(zhǎng)期被人們攝入會(huì)嚴(yán)重影響到身體健康。目前，用于三聚氰胺檢測(cè)的方法主要有：高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、電色譜儀檢測(cè)法等，但是，這幾種檢測(cè)方法均需要采用氮?dú)獯蹈蓛x，存在不能一次處理大量樣品、有毒氣體污染環(huán)境、消耗大量氮?dú)獾募夹g(shù)問(wèn)題。本文創(chuàng)新了一種新的檢測(cè)設(shè)備“真空離心濃縮儀”，同時(shí)優(yōu)化了檢測(cè)方法，能夠快速檢測(cè)三聚氰胺，同時(shí)具有以下優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)處理多個(gè)樣品而不會(huì)導(dǎo)致交叉污染；可以回收甲醇等有毒氣體，減少環(huán)境污染；回收的甲醇經(jīng)蒸餾處理后可以重復(fù)使用，降低了成本。

關(guān)鍵詞：食品；三聚氰胺；真空離心濃縮；檢測(cè)技術(shù)

三聚氰胺（Melamine）簡(jiǎn)稱(chēng)三胺，是一種三嗪類(lèi)含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)中。蛋白質(zhì)的平均含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16．6%，而三聚氰胺的含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)66．6%。由于全氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)不能區(qū)分這種“偽蛋白氮”，所以一些不法商家將其添加到食品中以提高蛋白質(zhì)含量。三聚氰胺不能被人體代謝，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的健康和利益，尤其是兒童，服用三聚氰胺超標(biāo)的食品，會(huì)導(dǎo)致腎結(jié)石[1-4]?！叭鼓谭凼录睂?dǎo)致大量?jī)和I結(jié)石，以三鹿，蒙牛，伊利等為首的乳品企業(yè)均在其產(chǎn)品內(nèi)檢出超標(biāo)的三聚氰胺，一時(shí)間引起了人們對(duì)三聚氰胺的高度關(guān)注，隨之，國(guó)家取消了食品類(lèi)商品免檢的待遇，這直接導(dǎo)致三聚氰胺的檢測(cè)量大增。

目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法》規(guī)定了三聚氰胺的檢測(cè)方法[5]，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有：高效液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法等，奶制品中也有采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)[10]。另外，目前一些檢測(cè)機(jī)構(gòu)提出采用電色譜儀進(jìn)行檢測(cè)[11]。針對(duì)這些檢測(cè)方法，液相色譜法的靈敏度較低，且分析時(shí)間較長(zhǎng)，氣質(zhì)、液質(zhì)聯(lián)用儀，電色譜儀雖然檢測(cè)靈敏度和分辨率很高，但是，這幾種檢測(cè)方法均需要采用氮?dú)獯蹈蓛x，氮?dú)獯蹈蓛x處理三聚氰胺樣品雖然能夠較快的處理樣品，但是，氮?dú)獯蹈蓛x一次只能處理少量樣品，增加了檢測(cè)時(shí)間，無(wú)法滿足目前大量檢測(cè)樣品需同時(shí)檢測(cè)的需求；從試管內(nèi)被氮?dú)獯祾叨鴵]發(fā)出來(lái)的有機(jī)溶劑不經(jīng)任何處理，直接散發(fā)到周?chē)h(huán)境中，這些溶劑常常是強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)。直接操作的實(shí)驗(yàn)人員極易因此出現(xiàn)健康問(wèn)題，而這些溶劑揮發(fā)到空氣里，也會(huì)對(duì)周?chē)h(huán)境造成危害，包括辦公室工作人員，周?chē)G化等。蒸汽會(huì)腐蝕儀器（針頭），導(dǎo)致交叉污染；另外，氮?dú)獯蹈蓛x本身于由于長(zhǎng)期處在這種環(huán)境中，也會(huì)很快出現(xiàn)生銹等被腐蝕現(xiàn)象，雖然有些氮?dú)獯蹈蓛x的設(shè)計(jì)將針頭包上一層PTFE以防腐，但針的尾部和儀器其它部件無(wú)法全部包上PTFE，不僅影響美觀、性能，而且在操作時(shí)稍有不慎，便會(huì)將鐵銹等碰落到樣品中，造成樣品污染；氮?dú)獯蹈刹僮髀闊?，必須有人一直看守，增加了檢測(cè)人員的負(fù)擔(dān)；消耗大量氮?dú)?，增加檢測(cè)成本。由此可見(jiàn)，改進(jìn)氮?dú)獯蹈蓛x在三聚氰胺檢測(cè)中的缺陷是非常必要的[12]。

本文創(chuàng)新了一種新三聚氰胺的檢測(cè)設(shè)備“真空離心濃縮儀”，同時(shí)優(yōu)化了檢測(cè)方法，解決了目前檢測(cè)方法存在的不能一次處理大量樣品，有毒氣體污染環(huán)境，消耗大量氮?dú)獾募夹g(shù)問(wèn)題。

1　試驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

安捷倫7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（配備混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱）：美國(guó)安捷倫公司；CHRIST SpeedDry 2-33IR真空離心濃縮儀：德國(guó)CHRIST公司。

乙酸鉛（分析純）、三氯乙酸、甲醇（色譜級(jí)）、優(yōu)純級(jí)吡啶、N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺、三甲基氯硅烷、三聚氰胺，以上試劑均由天津化學(xué)試劑有限公司提供。1.2試驗(yàn)條件

GC-MS色譜條件：色譜柱：5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；流速：1.0 mL/min；程序升溫：70℃保持1min，以10℃/min的速率升溫至200℃，保持10 min；傳輸線溫度：280℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL；電離方式：電子轟擊電離（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；掃描模式：選擇離子掃描，定性離子m/z 99、171、327、342，定量離子m/z 327。

1.3方法

1.3.1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.01、0.02、0.2、0.4、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存，有效期3個(gè)月。

1.3.2樣品的提取

液態(tài)奶、奶粉、酸奶和奶糖等稱(chēng)取5.00 g樣品于50 mL具塞比色管，加入30 mL濃度1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的三氯乙酸溶液，渦漩振蕩40 s以上，再加入10 mL濃度1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液，超聲提取20 min以上，加入2 mL、濃度22 g/L的乙酸鉛溶液，用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混勻后，轉(zhuǎn)移上層提取液29 mL～32 mL至50 mL的離心試管，以5 000 r/min離心15 min以上，得到待凈化的上清液。

奶酪、奶油和巧克力等稱(chēng)取5.00 g樣品于50 mL具塞比色管中，用5 mL熱水溶解或者在加熱的條件下溶解，再加入25 mL濃度1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的三氯乙酸溶液，渦漩振蕩40 s以上，再加入10 mL三氯乙酸溶液超聲提取20 min以上，加入2 mL、濃度22 g/L的乙酸鉛溶液，用1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸溶液定容至刻度；充分混勻后，轉(zhuǎn)移上層提取液29 mL～32 mL至50 mL的離心試管，以5 000 r/min離心15 min以上，得到待凈化的上清液。

1.3.3上清液的凈化

取基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物的混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱，先依次用3 mL～4 mL甲醇、5 mL～6 mL水活化；移取5 mL的待凈化濾液至固相萃取柱中。再用3 mL～5 mL水、3 mL～5 mL甲醇淋洗，淋洗液送入回收裝置，抽近干后用3 mL～5 mL體積分?jǐn)?shù)5%的氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液；所述氨化甲醇是5 mL摩爾濃度為25%～28%的氨水和95 mL甲醇，混勻后備用。

1.3.4離心濃縮

將12～24份（樣品量調(diào)整到偶數(shù)，單數(shù)量樣品可以用空的離心管配級(jí)成偶數(shù)）樣品收集得到的洗脫液同時(shí)放入到真空離心濃縮儀的離心管中，進(jìn)行真空離心干燥，在真空狀態(tài)下輻射加熱樣品；并利用真空離心濃縮儀的冷阱捕捉溶劑蒸氣，冷卻，回收，送入回收裝置。

所述真空離心濃縮儀主要由：離心主機(jī)、冷阱、真空泵三部分組成，這算是一種在真空狀態(tài)下離心樣品，從而將溶劑蒸發(fā)以濃縮或干燥樣品的儀器。并通過(guò)超低溫的冷阱捕捉溶劑。離心濃縮后的樣品可方便的用于各種定性和定量的分析。離心濃縮技術(shù)融合了離心、抽真空和熱量3種因素，用于有效的蒸發(fā)各種溶劑。

離心：轉(zhuǎn)速1 000 r/min，防止爆沸及樣品的損失。干燥后的溶質(zhì)完全沉積在容器的底部，便于樣品的完全回收。

抽真空：加速溶劑在SpeedVac濃縮儀中的蒸發(fā)。在濃縮過(guò)程中，樣品始終處于一種低于室溫的環(huán)境，可以防止熱敏感樣品的部分失活。此外，真空狀態(tài)還能防止樣品的氧化。

熱量：加速樣品的蒸發(fā)速率。在沒(méi)有外來(lái)熱量的狀態(tài)下，水溶液會(huì)在濃縮過(guò)程中結(jié)冰，本設(shè)備采用輻射加熱技術(shù)，彌補(bǔ)蒸發(fā)時(shí)的熱量損耗。熱輻射是真空狀態(tài)下給樣品加熱的最有效方式。

1.3.5衍生化

取上述干燥殘留物，加入600 μL的優(yōu)純級(jí)吡啶和200 μL衍生化試劑，混勻，70℃反應(yīng)40 min以上；所述衍生化試劑是由體積比99∶1的N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS），其中所述衍生化試劑是色譜純的。

1.3.6三聚氰胺的定量檢測(cè)

稱(chēng)取樣品5 g按上述方法處理后進(jìn)行空白試驗(yàn)，取樣品5 g加入適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液處理后按上述方法進(jìn)行GC-MS測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得到樣品中三聚氰胺的含量。

2　結(jié)果分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)濃度為1.0、20.0、40.0、80.0、100.0 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of the standard solution

三聚氰胺在1.0 mg/L～100 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：y=39.24x+5.056 7（y為樣品峰面積，x為樣品濃度），相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。

2.2方法的準(zhǔn)確度及精密度分析

稱(chēng)取空白牛奶5 g進(jìn)行空白試驗(yàn)，加入3個(gè)不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液處理后進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)分析3次，回收率范圍89.0%～105.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.14%～4.97%，其準(zhǔn)確度與精密度均符合殘留分析的要求。樣品添加回收率見(jiàn)表1。2.3甲醇回收率試驗(yàn)

表1　方法回收率試驗(yàn)Table 1　The average recoveries of the rapid screening method

稱(chēng)取不同量奶粉，按照本文方法處理，分別使用5、20、50 mL的甲醇進(jìn)行處理，得到洗脫液放入到甲醇蒸餾裝置中，得到純化的甲醇，甲醇的回收率在85%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）以上，重復(fù)利用率為80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）以上。

3　結(jié)論

采用本文所述方法檢測(cè)三聚氰胺具有以下優(yōu)點(diǎn)：

a）真空濃縮儀綜合利用離心力、加熱和外接真空泵提供的真空作用來(lái)進(jìn)行溶劑蒸發(fā)，可同時(shí)處理多個(gè)樣品而不會(huì)導(dǎo)致交叉污染。

b）冷阱能有效捕捉大部分對(duì)真空泵有損害的溶劑蒸氣，對(duì)高真空油泵提供有效的保護(hù)。

c）真空泵使系統(tǒng)處于真空狀態(tài)，降低溶劑的沸點(diǎn)，加快溶劑的蒸發(fā)速率。

d）可以同時(shí)處理大量樣品，最大可以同時(shí)處理24份樣品，并可同時(shí)處理多種樣品。

e）可以回收甲醇，最大可能的降低環(huán)境污染，回收的甲醇經(jīng)蒸餾處理后可以重復(fù)使用，甲醇的重復(fù)利用率達(dá)80%以上，降低了成本。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.038

收稿日期：2015-05-15

基金項(xiàng)目：獲得授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利：ZL201210402734.3一種三聚氰胺的檢測(cè)方法；實(shí)用新型專(zhuān)利：ZL201220540231.8一種三聚氰胺的檢測(cè)裝置

作者簡(jiǎn)介：于燕燕（1981—），女（漢），中級(jí)工程師，碩士研究生，主要從事出入境檢驗(yàn)檢疫工作。

Research of Rapid Detection of Melamine in Food

YU Yan-yan1，DU Feng2，WANG Na1
（1.Tianjin Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300308，China；2.Patent Examination
Cooperation Tianjin Center of The Patent Office，SIPO，Tianjin 300308，China）

Abstract：Melamine is widely used as raw material in various industries including plastics，papers and fertilizers，which can do harm to people's health if it is added to food.These incidents have promoted the development of various methods for detecting melamine in many kinds of food products，including highperformance liquid chromatography，gas chromatography，liquid chromatography-mass spectrum，gas chromatography-mass spectrum，and capillary electrophoresis，etc.However，Termovap Sample Concentrator is Indispensable for these detection measurements in which with the consuming large amounts of nitrogen and lacking the ability of dealing with large numbers of samples simultaneously and generating toxic gases byproduct which will pollute the environment.A new detection equipment"vacuum centrifugal concentrator"was innovated in this paper，while the detection method was optimized.This method can realize the rapid detection of melamine，also has the following advantages：it can simultaneously process a plurality of samples without cross contamination；methanol and other toxic gases can be recycled to reduce environmental pollution，recycling methanol can be reused after distilled treatment，by which can also reduce the cost.

Key words：food；melamine；vacuum centrifugal concentration；detection method