劉　冬，王盼亮，蒿洪欣，楊清香，2，*（.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省高校資源微生物與功能分子重點實驗室，河南新鄉(xiāng)453007）

生物工程

高產(chǎn)類胡蘿卜素酵母菌的誘變選育

劉冬1，王盼亮1，蒿洪欣1，楊清香1，2，*
（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007；2.河南省高校資源微生物與功能分子重點實驗室，河南新鄉(xiāng)453007）

摘要：從12株紅酵母菌中篩選得到一株生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量較高的菌株KC 8，以KC 8為出發(fā)菌株，依次經(jīng)ARTP誘變、亞硝酸鈉誘變、紫外誘變、紫外-亞硝酸鈉復(fù)合誘變，再進行一輪ARTP誘變。測得KC 8類胡蘿卜素產(chǎn)量為8.67 mg/L，26 S rDNA測序表明，該菌株與膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）100%相似性；最終從1 000株誘變存活菌株中篩選得到高產(chǎn)類胡蘿卜素突變菌株K 4，產(chǎn)量為15.14 mg/L，為出發(fā)菌株的1.75倍，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分析表明該菌株所產(chǎn)類胡蘿卜素的主要成分為β-胡蘿卜素。

關(guān)鍵詞：紅酵母；類胡蘿卜素；鑒定；誘變

類胡蘿卜素是一類具有抗氧化性功能的脂溶性色素的總稱，屬于多烯化合物，主要呈橙色、黃色或者紅色，廣泛地存在于植物、動物和部分微生物中[1-2]。工業(yè)生產(chǎn)中類胡蘿卜素常被用來作為天然的食品著色劑或者在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為飼料添加劑。近年來研究調(diào)查表明，類胡蘿卜素能夠抑制腫瘤的發(fā)生和生長，預(yù)防眼病和心血管病，增強人體的抗氧化能力，已被WHO、歐共體及FAO等國際組織認定為A類營養(yǎng)色素[3-5]。

目前，國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法主要包括3種：植物天然提取法，化學(xué)合成法以及微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法由于其成本低、工藝簡單、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)勢最具發(fā)展前途，目前微生物發(fā)酵研究主要集中在三孢不拉式霉菌和紅酵母兩方面[6-8]。三孢布拉霉菌生產(chǎn)類胡蘿卜素色素產(chǎn)量高，但其技術(shù)工藝復(fù)雜，發(fā)酵周期長。與三孢布拉霉菌相比，紅酵母類胡蘿卜素產(chǎn)量雖然低，但其生長周期短，營養(yǎng)要求簡單，易培養(yǎng)，發(fā)酵過程控制容易，因此對紅酵母生產(chǎn)胡蘿卜素的研究具有巨大潛在應(yīng)用價值和廣闊開發(fā)前景，選育高產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母菌株更具有實際意義[9-10]。本研究從實驗室保藏的紅酵母菌中篩選得到一株類胡蘿卜素產(chǎn)量較高的菌株作為誘變出發(fā)菌株，通過采用新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)與傳統(tǒng)誘變技術(shù)相結(jié)合的方式進行誘變選育，以獲得高產(chǎn)類胡蘿卜素的紅酵母菌株。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

紅酵母：由河南師范大學(xué)資源微生物與功能分子河南省高校重點實驗室保存，共優(yōu)選12株，編號依次為KC 1、KC 2、KC 3、KC 4、KC 5、KC 6、KC 7、KC 8、KC 9、KC 10、KC 11、KC 12。

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20（g/L），蛋白胨10（g/L），酵母膏5（g/L），瓊脂20（g/L），pH自然。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20（g/L），蛋白胨10（g/L），酵母膏5（g/L），pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖31.8（g/L），酵母膏1，（NH4）2SO42（g/L），KH2PO41（g/L），MgSO4·7H2O 0.5（g/L），無水CaCl20.1（g/L），NaCl 0.3（g/L），pH 7.0。

以上培養(yǎng)基均用滅菌鍋在0.1 MPa滅菌30 min。

1.2出發(fā)菌株的篩選[11]

取一環(huán)保藏菌種接種至斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)48 h活化菌種。用5 mL無菌水將斜面菌種洗下，轉(zhuǎn)接入裝液量為20 mL/100 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)36 h，獲得種子液。按10%接種量接入裝液量50 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，180r/min恒溫震蕩培養(yǎng)96 h。8000r/min離心10min，收集菌體測定酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量，選用類胡蘿卜素產(chǎn)量最高的紅酵母做為出發(fā)菌株進行誘變育種，并對該菌株進行菌落形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定[12]。

1.3儀器

ARTP II常壓室溫等離子體誘變儀：無錫思清源生物科技有限公司；安捷倫1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.4生物量的測定菌體生物量的測定采用菌體干質(zhì)量法[13]。

1.5類胡蘿卜素的提取和產(chǎn)量測定[3]

取3 mL發(fā)酵液于5 mL離心管中，8 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌3次，收集菌體，加入3 mol/L的鹽酸3 mL，混勻后室溫下浸泡40 min，沸水浴4 min后迅速冷卻，8 000 r/min離心10 min，去除HCl，向離心管中加入4 mL丙酮，室溫下震蕩以浸提類胡蘿卜素。

將浸提液適當稀釋后，利用分光光度計在487 nm處測定其吸光度值，然后按下式計算類胡蘿卜素的產(chǎn)量：

類胡蘿卜素產(chǎn)量/（mg/L）=Aλmax×D×V/0.16×V0

式中：Aλmax為類胡蘿卜素在最大吸收波長（487nm）下的吸光度值；V為提取色素所用溶劑量，L；D為測定試樣時的稀釋倍數(shù)；V0為所用的發(fā)酵液總體積，L；0.16為類胡蘿卜素的分子消光系數(shù)。

1.6酵母菌生長曲線的測定[14]

菌株在斜面培養(yǎng)基上活化后，取一環(huán)接種至種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中從4 h后開始，每隔2小時取樣測菌液在600 nm處的OD值，培養(yǎng)時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.7誘變處理及正向突變菌株的篩選

菌懸液的制備：從斜面活化培養(yǎng)基上挑取適量菌體接種到種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3遍，重懸浮，制成菌體細胞濃度為108cfu/mL的菌懸液。

常壓室溫等離子體（ARTP）誘變：采用ARTP II常壓室溫等離子體誘變儀對菌懸液進行誘變處理。固定儀器的電源功率、氣流量、等離子體發(fā)射源與菌懸液之間的距離等條件，將處理時間作為誘變的可變參數(shù)[15]。在本研究中ARTP的設(shè)定條件為：處理距離2 mm，處理功率120 W，氣流量10 SLM，處理時間分別為0、30、60、90、120、150、180 s，處理后菌懸液進行適當稀釋涂布到固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，計算致死率并繪制致死曲線，篩選出類胡蘿卜素產(chǎn)量最高的突變菌株作為亞硝酸鈉誘變的出發(fā)菌株。

亞硝酸鈉誘變（NaNO2）誘變：取菌懸液1 mL于無菌錐形瓶，加入1 mol/L的醋酸緩沖液（pH 4.5）2 mL，0.1 mol/L的亞硝酸鈉1 mL（對照組不加入亞硝酸鈉），在26℃下分別保溫10、15、20、25、30 min后每個樣中快速加入20 mL 0.07 mol/L的磷酸氫二鈉溶液（pH 8.6）終止反應(yīng)后，適當稀釋涂布到固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，計算致死率，繪制致死曲線圖，篩選出類胡蘿卜素產(chǎn)量最高的突變菌株作為紫外誘變的出發(fā)菌株。

紫外（UV）誘變：取10 mL菌懸液于9 cm的無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于穩(wěn)定發(fā)光20 min后的15 w紫外燈下25 cm處，攪拌狀態(tài)下照射，照射時間分別為0、20、40、60、80、100、120、140 s。此過程都必須在黑暗或紅光中進行，防止光復(fù)活。紫外處理后的菌液適當稀釋涂布到固體培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，計算致死率，繪制致死曲線圖，篩選出類胡蘿卜素產(chǎn)量最高的突變菌株作UV-NaNO2復(fù)合誘變的出發(fā)菌株。

UV-NaNO2復(fù)合誘變：選取亞硝酸鈉誘變致死率為85%左右的誘變劑量對菌懸液進行誘變，將誘變處理后的菌懸液用紫外誘變致死率為85%左右的誘變劑量進行誘變，篩選出類胡蘿卜素產(chǎn)量最高的突變菌株作再一次ARTP誘變的出發(fā)菌株。

正向突變菌株的篩選：從突變株中挑選紅色或橙紅色，生長良好的單菌落，取一環(huán)接種至裝液量為20 mL/100 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，獲得種子液。按照前述酵母生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量測定的方法進行高產(chǎn)菌株的篩選。

1.8遺傳穩(wěn)定性實驗

將篩選獲得的高產(chǎn)類胡蘿卜素紅酵母菌株接種至斜面固體培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，共傳10代，取第0、2、4、6、8、10次傳代的菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測其生物量和類胡蘿卜素產(chǎn)量，檢測篩選得到的高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.9類胡蘿卜素成分分析[16]

按1.5方法提取紅酵母的類胡蘿卜素后，浸提液用0.45 μm濾膜過濾后制得類胡蘿卜素樣品，利用高效液相色譜儀分析類胡蘿卜素樣品中的組分。

液相條件：流動相A為乙腈∶甲醇（95∶5，體積比）；流動相B為乙腈∶甲醇∶乙酸乙酯（60∶20∶20，體積比）。

色譜條件：100%A保持5 min，13 min時100% B，保持100%B至完成，流速1 mL/min，柱溫28℃，進樣量20 μL，檢測波長487 nm。

2　結(jié)果及分析

2.1出發(fā)菌株的篩選及鑒定

按照材料與方法所述對紅酵母進行初篩，從12株紅酵母中獲得一株生物量，類胡蘿卜素含量及類胡蘿卜素產(chǎn)量均較高的菌株KC 8，其生物量為（10.02± 0.12）g/L，類胡蘿卜素含量為（0.87±0.01）mg/g，類胡蘿卜素產(chǎn)量為（8.67±0.07）mg/L。

菌株KC 8在固體培養(yǎng)基上菌落呈橙紅色，圓形，表面光滑，較濕潤，邊緣無缺刻；經(jīng)番紅染色后在顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1。

圖1　菌株KC8的顯微形態(tài)（×1 000）Fig.1　Micrographic observation of strain KC 8（×1 000）

圖1表明，細胞呈圓形或橢圓形，細胞長約3μm～5μm，寬約2μm～3μm，無成簇、成鏈現(xiàn)象。對其26SrDNA片段進行測序（GenBank登錄號：KP760069）并在NCBI進行Blast同源性檢索，結(jié)果表明與Rhodotorula mucilaginosa有100%的相似性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2　基于26 S rDNA基因序列的系統(tǒng)進化樹Fig.2　Phylogenetic tree based on 26 S rDNA sequences

圖2表明，KC 8與Rhodotorula mucilaginosa聚為一簇，因此該紅酵母菌株KC 8的鑒定結(jié)果為膠紅酵母（R.mucilaginosa）。

2.2菌株生長曲線的測定

誘變處理一般選取對數(shù)期的菌株，此時菌體生長狀況比較同步，代謝活性高而穩(wěn)定，生活力強，易變異且重復(fù)性好。對出發(fā)菌株的生長曲線測定結(jié)果如圖3所示。

圖3　菌株KC 8的生長曲線Fig.3　The growth curve of initial strain KC 8

由圖3可以看出，菌株KC8在培養(yǎng)12h～24h期間處于對數(shù)期，因此選取培養(yǎng)20h后的菌液進行誘變處理。

2.3誘變劑量的選擇

ARTP誘變的致死結(jié)果如圖4 A所示。隨著照射時間的延長，致死率逐漸升高，當照射時間為120 s時，致死率接近100%，當致死率在85%左右時，有較高的正突變率[17]，因此選擇照射時間為120 s。NaNO2誘變的致死率結(jié)果如圖4 B所示，一經(jīng)NaNO2誘變處理，菌體細胞就開始死亡，致死率隨誘變處理時間的延長逐漸升高，處理時間為20 min時菌體細胞死亡率達到98.4%。當致死率在85%左右時，有較高的正突變率，因此選擇NaNO2誘變處理時間為15 min。紫外誘變的致死率結(jié)果如圖4 C所示，菌體細胞受到紫外照射便開始死亡，并且隨照射時間的延長死亡率平緩上升。紫外照射時間為100 s時，菌體細胞死亡率達到97.8%，照射時間為80 s時，菌體細胞死亡率為83.2%，因此，為了獲得高的正突變率，紫外照射時間應(yīng)為80 s。2.4高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株的篩選

按照方法1.7對紅酵母菌株KC 8進行誘變處理，從每次誘變后獲得的突變株中各挑選出200株生長良好的菌株，測其生物量，類胡蘿卜素含量及類胡蘿卜素產(chǎn)量，并計算各誘變方法的正突變率，各誘變方法篩選獲得的最高類胡蘿卜素產(chǎn)量及類胡蘿卜素產(chǎn)量正突變率結(jié)果如表1。

圖4　不同誘變條件下的致死曲線Fig.4　Lethal curves of starting strains under different mutation conditions

表1　不同誘變條件下獲得的最高類胡蘿卜素產(chǎn)量及正突變率Table 1　The highest carotenoid yields and positive mutation rates obtained by using different mutation methods

ARTP誘變是一種新型誘變技術(shù)，和傳統(tǒng)誘變方法相比，ARTP誘變對遺傳物質(zhì)的損傷機制多樣，獲得突變型多樣性的可能性較大，研究結(jié)果表明，ARTP技術(shù)可以快速有效地突變細菌、放線菌、霉菌、酵母等微生物[18-20]。從表1可以看出，ARTP誘變的正突變率明顯高于其他誘變手段，但對類胡蘿卜素產(chǎn)量的提高則與其他方法相近。

從表1結(jié)果可以看出，酵母菌經(jīng)過ARTP、NaNO2、紫外線、以及NaNO2-紫外線聯(lián)合誘變之后，再一次利用ARTP誘變?nèi)匀荒軌虻玫?7%的正突變率，因此具有進一步提升產(chǎn)量的可能和空間，但是產(chǎn)量提高的幅度很小，需要進一步研究誘變和篩選的條件。通過誘變選育，最終篩選獲得的突變株編號K4，其生物量為（14.42±0.04）g/L，類胡蘿卜素含量為（1.05±0.01）mg/g，類胡蘿卜素產(chǎn)量為（15.14±0.12）mg/L。近年來，很多文獻報道利用紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素，但是利用ARTP與傳統(tǒng)誘變方法相結(jié)合誘變酵母菌選育高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株的研究卻沒有報道。Cutzu R等[16]通過對粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）菌株進行紫外誘變，突變株在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中類胡蘿卜素產(chǎn)量最高為（14.07±1.45）mg/L；鄭曉吉等[21]對天山紅酵母BC-1的發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后，類胡蘿卜素產(chǎn)量最高為10.08 mg/L；Frengova GI等[22]報道的斯魯菲亞紅酵母（Rhodotorula slooffiae）的類胡蘿卜素產(chǎn)量最高為2.67 mg/L。本實驗通過誘變選育獲得的突變株K 4的類胡蘿卜素產(chǎn)量均高于上述報道，有很大的開發(fā)價值。與出發(fā)菌株KC 8相比，突變株K 4的生物量、類胡蘿卜素含量及類胡蘿卜素產(chǎn)量分別是出發(fā)菌株KC 8的1.44倍，1.21倍和1.75倍。

2.5遺傳穩(wěn)定性實驗

為了考察菌株K 4的遺傳穩(wěn)定性，將其傳代10次，取第0、2、4、6、8、10次傳代的菌進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測得其生物量、類胡蘿卜素含量及類胡蘿卜素產(chǎn)量，實驗結(jié)果見表2。

表2　突變株K 4的遺傳穩(wěn)定性Table 2　The hereditary stability of mutant strain K 4

表2結(jié)果表明菌株K4傳代10次,其生物量、類胡蘿卜素含量及類胡蘿卜素產(chǎn)量基本穩(wěn)定，說明突變菌株K 4有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.6類胡蘿卜素成分分析

利用β-胡蘿卜素標準品作為對照，將制得的類胡蘿卜素樣品按照方法1.9中的色譜條件進行HPLC上樣分析，色譜圖結(jié)果如圖5中A和B所示。

圖7　菌株K 4產(chǎn)生的類胡蘿卜素的高效液相色譜圖Fig.7　The liquid chromatogram of β-carotene standard（A）and carotenoid of strain K 4（B）

由圖7可知，β-胡蘿卜素標準品的出峰時間和菌株K 4所產(chǎn)類胡蘿卜素樣品的主峰出峰時間基本一致，因此，從峰面積大小可以認定菌株所產(chǎn)類胡蘿卜素主要成分為β-胡蘿卜素。樣品圖譜中還有其它的峰，說明該類胡蘿卜素樣品還有其他組分，有待進一步對其成分進行分析。

3　結(jié)論

本試驗通過對實驗室保藏的紅酵母進行初篩，得到一株類胡蘿卜素產(chǎn)量較高的紅酵母菌株KC 8，經(jīng)鑒定為膠紅酵母（R.Mucilaginosa），其類胡蘿卜素產(chǎn)量為（8.67±0.07）mg/L，對菌株KC 8進行誘變選育，篩選獲得一株高產(chǎn)類胡蘿卜素的突變菌株K 4，類胡蘿卜素產(chǎn)量為（15.14±0.12）mg/L，所產(chǎn)類胡蘿卜素經(jīng)HPLC檢測表明主要成分為β-胡蘿卜素。該菌株生長性能良好，遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)類胡蘿卜素能力較強，是一株具有開發(fā)前景的優(yōu)良高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株。

今后的研究重點應(yīng)放在進一步優(yōu)化菌株K 4發(fā)酵培養(yǎng)條件以及類胡蘿卜素的提取方法，尋找廉價的碳源替代葡萄糖，構(gòu)建基因工程菌等方面，以提高菌株的類胡蘿卜素產(chǎn)量，降低發(fā)酵成本，推進利用紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素的工業(yè)化進程。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.042

收稿日期：2015-02-13

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助（NSFC 21277041）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團隊資助（13IRTSTHN009）

作者簡介：劉冬（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：環(huán)境微生物。

*通信作者：楊清香（1966—），女（漢），博士，教授，研究方向：環(huán)境微生物。

Mutation Breeding of Yeast with High Carotenoids Production

LIU Dong1，WANG Pan-liang1，HAO Hong-xin1，YANG Qing-xiang1，2，*
（1.College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China；2.Key Laboratory for Microorganisms and Functional Molecules，Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China）

Abstract：One yeast strain（KC 8）from 12 was selected and identified due to relatively high biomass and high production of carotenoids（8.67 mg/L）.Sequence of 26 S rDNA indicated that KC 8 had 100%identity with Rhodotorula mucilaginosa.Using KC 8 as a starting strain，a series of mutation methods，ARTP，NaNO2，UV light，combination of NaNO2and UV light were applied to increase the carotenoids production.Finally，K 4 was obtained from 1 000 strains of screening.The yield of carotenoids by K 4 was 15.14 mg/L，which was 1.75 times of the starting strain，KC 8.High performance liquid chromatography（HPLC）analysis indicated that the main component of carotenoids was β-carotene.

Key words：Rhodotorula；carotenoids；identification；mutation