駱廣濤，王本忠

m iRNA-4465過表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲的影響及其機制

駱廣濤，王本忠

摘要目的探討miRNA-4465的過表達(dá)對乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞遷移侵襲能力的影響及機制。方法將miRNA-4465的模擬物（minics）轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞，通過實時定量PCR檢測miRNA-4465的表達(dá)變化；運用Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miRNA-4465的潛在靶基因，并通過熒光報告載體實驗及Western blot加以證實。結(jié)果與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miRNA-4465 minics組miRNA-4465表達(dá)水平明顯升高（P＝0．001）。Transwell遷移實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-4465 minics組細(xì)胞遷移能力減弱（P＝0．001）；Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-4465 minics組細(xì)胞侵襲能力降低（P＝0．010）。通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了EZH2為miRNA-4465的潛在靶基因；熒光報告載體實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-4465 minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）后熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染陰性對照序列（NC）＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）降低66%（P＝0．001）。此外將miRNA-4465轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞后EZH2蛋白表達(dá)降低。結(jié)論miRNA-4465能降低MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這個過程可能是通過調(diào)控EZH2基因的表達(dá)實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞miRNA-4465；EZH2；乳腺腫瘤；轉(zhuǎn)移

2015-07-31接收

王本忠，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangbenzhong2459＠126．com

乳腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制對于提高轉(zhuǎn)移乳腺癌患者生存率和改善患者生活質(zhì)量具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）已經(jīng)證實能潛在促進(jìn)或抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移［1］。近年來研究［2-4］表明，miRNA-26家族與多種腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲有關(guān)，如肺癌、肝癌及膀胱癌等。miRNA-26家族由miRNA-26a、miRNA-26b、miRNA-1297和miRNA-4465等 4個種子區(qū)序列相同（UCAAGUA）的miRNA組成。目前對于miRNA-26家族參與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的研究主要集中在miRNA-26a、miRNA-26b、miRNA-1297，而miRNA-4465在乳腺癌轉(zhuǎn)移侵襲過程中的作用研究甚少。該研究擬通過將miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染入具有高侵襲性的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，檢測miRNA-4465對MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲能力的影響，探討其作用的分子機制。

1　材料與方法

1．1材料乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院朱濤教授惠贈，細(xì)胞來源于美國模式培養(yǎng)物集存庫；牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基及Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Transwell小室購自Corning公司；Lipofectamine 2000購自 Invitrogen公司；miRNA-4465 mimics購自銳博公司；Matrigel膠購自BD公司；EZH2抗體購自Cell Signaling Tech公司，GAPDH抗體購自Abcam公司；質(zhì)粒psiCHECK2及雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司；限制性內(nèi)切酶Xho I、Not I及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；DNA連接試劑盒及實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；DNA小抽及中抽試劑盒購自Axygen公司。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞，置于 5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)每隔2～3 d換新鮮培養(yǎng)基一次。

1．2．2實驗分組根據(jù)轉(zhuǎn)染情況將實驗分為陰性對照組（NC組）及 miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染步驟參考Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書。

1．2．3實時定量PCR運用實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染miRNA-4465 minics至MDA-MB-231細(xì)胞后miRNA-4465的相對表達(dá)量。miRNA-4465 minics序列：5′-CUCAAGUAGUCUGACCAGGGGA-3′。首先 TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件為42℃60min，70℃10 min。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物為模板，使用實時定量PCR檢測miRNA-4465的相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)置2個復(fù)孔。內(nèi)參照為U6。HsamiRNA-4465引物序列F：5′-CUCAAGUAGUCUGAC-3′，R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。實時定量PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性40 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，溶解曲線條件：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的Ct值（Ct值為反應(yīng)中每個反應(yīng)管內(nèi)的實時熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)），通過2-ΔΔCt法計算樣品中miRNA-4465的相對表達(dá)量。

1．2．4細(xì)胞遷移和侵襲實驗在進(jìn)行侵襲實驗時，首先用50 mg／LMatrigel1∶8稀釋包被Transwell小室底部膜的上室面。消化細(xì)胞后離心棄去培養(yǎng)液，用含有牛血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至4×108個／L。下室加入600μl含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，24～48 h后棄去下室培養(yǎng)基，90%乙醇溶液室溫固定30 min。晾干后使用0．1%結(jié)晶紫溶液室溫染色10 min。用棉簽擦去上室的細(xì)胞，檢測下室的細(xì)胞數(shù)目并隨機取5個視野拍照。遷移實驗不需要鋪Matrigel膠，其余實驗步驟與侵襲實驗一致。

1．2．5miRNA-4465靶標(biāo)基因預(yù)測由于miRNA與其潛在靶基因的結(jié)合具有一定的規(guī)律性，可以通過生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行編程從而預(yù)測miRNA的潛在靶標(biāo)基因。通過在線miRNA靶基因預(yù)測工具TargetScan、PicTar和miRanda 3個數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測miRNA-4465的潛在靶點。

1．2．6熒光報告載體實驗從NCBI中下載人EZH2基因序列，采用Primer5．0軟件設(shè)計引物，并使用PCR法擴增EZH2 3’UTR。將EZH2 3’UTR序列插入到psiCHECK2質(zhì)粒中，并將miRNA-4465相應(yīng)識別位點突變后插入到psiCHECK2質(zhì)粒中構(gòu)建突變型質(zhì)粒。EZH2 3’UTR（野生型）引物序列F：5′-TATATTCTCGAGCATCTGCTACCTCCTCCCC-3′，R：5′-TATATGCGGCCGCCAAGTTCAAGTATTCTTAT-3′；Mut-EZH2 3’UTR（突變型）引物序列F：5′-CTTTTTATTGCCTTCTCAGGTCCTGCAAAGTGTTTG-3′，R：5′-CAAAACACTTTGCAGGACCTGAGAAGGCAATAAAAAG-3′。PCR反應(yīng)條件為：98℃5 s，98℃10 s，50℃5 s，72℃1 min，32個循環(huán)后72℃延伸2 min。分離PCR擴增的產(chǎn)物并純化。Xho I 和Not I雙酶切PCR產(chǎn)物及psiCHECK2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化篩選陽性克隆，挑克隆后接種于4 ml含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)10 h，小抽提取質(zhì)粒后測序。擴增克隆并提純質(zhì)粒。將MDAMB-231細(xì)胞傳至T25培養(yǎng)瓶中，待其細(xì)胞生長至30%～40%密度時將細(xì)胞消化，重懸并計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至5×105／ml，向24孔板中每孔加入20μl細(xì)胞懸液（即1萬個細(xì)胞），用Lipofectamine 2000進(jìn)行組合轉(zhuǎn)染。實驗分組如下：野生型組：轉(zhuǎn)染入陰性對照序列＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）和miRNA-4465minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）；突變型組：轉(zhuǎn)染入陰性對照序列＋psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）和miRNA-4465 minics＋psiCHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，加入100μl的細(xì)胞裂解液（Lysis Buffer），置于搖床避光孵育15 min。吸取細(xì)胞裂解混合液，10 000 r／min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。在熒光素酶報告基因檢測儀上檢測螢火蟲熒光素酶的活性值。樣品熒光素酶活性＝（海腎熒光素酶活性值-本底值）／（螢火蟲熒光素酶活性值-本底值）。每組實驗重復(fù)3次。

1．2．7Western blot法轉(zhuǎn)染后待細(xì)胞長滿6孔板，使用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次。將PBS棄去，并迅速加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。收取蛋白后采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測蛋白濃度，然后加入5×上樣緩沖液在100℃沸水浴中煮沸10 min。等量蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA恒流60～90 min。轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，一抗4℃孵育過夜。二抗室溫孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16．0及Excel軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料結(jié)果用±s表示。兩組均數(shù)比較采用t檢驗。

2　結(jié)果

2.1MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染m iRNA-4465 m inics后m iRNA-4465表達(dá)的改變miRNA-4465在NC組和miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染組的相對表達(dá)量分別為0．99±0．10、38．69±1．70。與NC組相比，miR-NA-4465 minics轉(zhuǎn)染組miRNA-4465表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝39．275，P＝0．001）。

2.2MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染m iRNA-4465 m inics后遷移和侵襲能力的改變

2．2．1對細(xì)胞遷移能力的影響Transwell遷移實驗結(jié)果顯示NC組和miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染組細(xì)胞計數(shù)分別為156．67±9．29、85．67±6．03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝34．715，P＝0．001），見圖1。Transwell遷移實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miRNA-4465后MDAMB-231細(xì)胞遷移能力降低。

2．2．2對細(xì)胞侵襲能力的影響結(jié)果顯示NC組和miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞計數(shù)分別為159．67±18．18、93．00±11．00，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝10．151，P＝0．010），見圖2。Transwell侵襲實驗實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miRNA-4465后MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力降低。

2.3生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測 EZH2為 m iRNA-4465的靶標(biāo)基因通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了EZH2可能為miRNA-4465的潛在靶基因。圖3中為TargetScan軟件測出EZH2 3’UTR第250～257位（即斜體字部分）為miRNA-4465結(jié)合靶點。

2.4熒光報告載體實驗證實m iRNA-4465與EZH2基因的靶向關(guān)系結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染入psi-CHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）＋miRNA-4465 minics后熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染陰性對照序列（NC）＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）降低66．0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．001）；而轉(zhuǎn)染入psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）＋miRNA-4465 minics后熒光素酶活性較陰性對照序列（NC）＋psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突變型）變化不大（下調(diào)3．0%，P＝0．767），見圖4。熒光報告載體實驗證實miRNA-4465可以與EZH2 3’UTR結(jié)合，表明EZH2是miRNA-4465的直接作用靶點。

2.5MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染m iRNA-4465 m inics后EZH2蛋白的表達(dá)變化與NC組相比，將miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后EZH2蛋白表達(dá)降低。見圖5。

3　討論

miRNA是一類長度約為19～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，可以通過其種子序列與靶基因的mRNA3’非翻譯區(qū)（3’UTR）結(jié)合而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。目前已知的促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的miRNA有miRNA-21、miRNA-22、miRNA-103、miRNA-182、miRNA-143和miRNA-520c等；而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的miRNA有miRNA-20a／b、miRNA-126、miRNA-205、miRNA-15b和miRNA-200家族等［5］。miRNA-26家族成員中miRNA-26a已經(jīng)證實能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力［6］，而具有與miRNA-26a相同種子序列的miRNA-4465是否具有此功能尚不明確。本實驗將miRNA-4465 minics轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞后，成功上調(diào)了miRNA-4465的表達(dá)。隨后運用Transwell遷移和侵襲實驗檢測了轉(zhuǎn)染miRNA-4465 minics后細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變，結(jié)果顯示MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力均顯著降低。TargetScan、PicTar和miRanda三種在線預(yù)測工具預(yù)測miRNA-4465潛在的靶標(biāo)基因。TargetScan預(yù)測EZH2可能是miRNA-4465的靶標(biāo)基因。本實驗挑選了EZH2作為下一步的研究基因是因為：①EZH2蛋白在乳腺癌等多種惡性腫瘤內(nèi)高表達(dá)；②EZH2蛋白與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［7］；③此前已經(jīng)有研究［6］表明在乳腺癌細(xì)胞中miRNA-26a能調(diào)控EZH2基因的表達(dá)。miRNA-4465作為miRNA-26a同家族成員，具備相同的種子序列，也可能與EZH2 mRNA 3’UTR結(jié)合使其降解。在通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測了EZH2可能是miRNA-4465的下游靶標(biāo)基因后，采用熒光報告載體實驗驗證了miRNA-4465與EZH2基因的靶向關(guān)系。人EZH2基因是果蠅zeste基因增強子的同源基因，屬于多梳蛋白復(fù)合物（PcG）基因家族成員。EZH2蛋白作為EZH2基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是表觀遺傳學(xué)中多梳阻遏蛋白PRC2的一個重要的催化亞基，它具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，能將組蛋白H3上第27位賴氨酸三甲基化（H3K27me3），從而沉默下游基因。

目前關(guān)于miRNA-26家族調(diào)控EZH2基因的研究主要集中在miRNA-26a中。Zhang et al［8］通過研究證實在乳腺癌組織中miRNA-26a的表達(dá)降低，而EZH2基因表達(dá)升高。通過將外源性的miRNA-26a轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，原先高表達(dá)的EZH2表達(dá)降低。Jansen etal［9］在他莫昔芬耐藥乳腺癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)EZH2基因在上游受到miRNA-26a的調(diào)控。本實驗結(jié)果表明了miRNA-4465與EZH2的靶向作用關(guān)系，而EZH2已經(jīng)證實能促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，miRNA-4465對MDA-MB-231細(xì)胞遷移侵襲能力的影響是否是通過調(diào)控EZH2基因?qū)崿F(xiàn)的，還需要進(jìn)一步研究。

根據(jù)miRNA-4465在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中所扮演的角色可以為未來開展乳腺癌治療提供新思路，即通過外源性導(dǎo)入miRNA-4465從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移。已經(jīng)有研究者發(fā)現(xiàn)通過外源性導(dǎo)入miRNAs能通過增加抗瘤活性從而抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移［10］。鑒于表觀遺傳學(xué)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，靶向抑制EZH2的表達(dá)也有可能成為乳腺癌治療的一個新策略。目前人們已經(jīng)研發(fā)了一些高選擇性的EZH2抑制劑，如GSK126及GSK343等［11］。miRNA-4465和EZH2均有可能作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療新靶點，為未來乳腺癌的治療提供新的方向。

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中圖分類號R 737．9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1570-05

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：11040606M180）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，合肥230022

作者簡介：駱廣濤，男，碩士研究生；