沈麗麗，何家才

羥基磷灰石／殼聚糖復(fù)合微球的制備及其生物學(xué)作用的體外研究

沈麗麗1，2，3，何家才1，2，3

摘要目的通過探究羥基磷灰石（HAp）殼聚糖（CS）復(fù)合微球支架對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響，評估其作為骨組織工程支架的可行性。方法納米HAp和CS復(fù)合物通過微流體技術(shù)自組裝成微球支架，顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察。將P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）與微球行體外共培養(yǎng)，計算前6 h黏附率。培養(yǎng)1、3、6、9 d，計算增殖率并用GraphPad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；行掃描電鏡及共聚焦掃描式顯微鏡檢測，觀察細(xì)胞黏附及分布。將細(xì)胞微球復(fù)合物填入自制模具中培養(yǎng)14～21 d，進(jìn)行形態(tài)觀察。結(jié)果顯微鏡鏡下微球?yàn)橥暾膱A形，大小一致。BMSCs與微球體外培養(yǎng)6 h，黏附率達(dá)90%以上。6 d時，BMSCs的增殖率達(dá)到最高。掃描電鏡結(jié)果顯示微球上有大量BMSCs黏附定植并分泌大量胞外基質(zhì)將微球連接成整體；共聚焦掃描式顯微鏡結(jié)果可見明顯的細(xì)胞骨架微絲蛋白。細(xì)胞微球體外模具培養(yǎng)18 d后，形成了結(jié)構(gòu)完整的組織塊。結(jié)論HAp-CS微球是一種良好的促BMSCs種子細(xì)胞黏附定植的支架材料，是促進(jìn)細(xì)胞生長的有效支撐載體，與共培養(yǎng)細(xì)胞形成的復(fù)合組織塊有望應(yīng)用于體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)修復(fù)標(biāo)準(zhǔn)缺損。

關(guān)鍵詞羥基磷灰石-殼聚糖微球；仿生支架；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；黏附；增殖

2015-06-23接收

何家才，男，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：hejiacai＠163．com

運(yùn)用組織工程骨進(jìn)行骨組織再生修復(fù)已成為當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一。而生物支架在骨缺損的修復(fù)過程中起到關(guān)鍵性作用，被譽(yù)為組織工程的“基石”。復(fù)合類仿生支架（有機(jī)物與無機(jī)物結(jié)合）可以模擬天然成熟骨組織的結(jié)構(gòu)，在促進(jìn)干細(xì)胞增殖、骨向分化等方面具有顯著優(yōu)勢［1］。羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）作為人體骨骼和牙齒的主要組成，生物相容性良好，并有足夠的機(jī)械強(qiáng)度可承受體內(nèi)壓力；納米級HAp利于成骨細(xì)胞黏附，具有骨誘導(dǎo)性，常被作為仿生支架的制備原料［2］。殼聚糖（chitosan，CS）作為一種天然的再生來源聚合物，生物性能佳，易于化學(xué)改性并對體內(nèi)大分子有高度親和性，是一類頗有前景的組織工程支架材料［3］。該研究采用微流體技術(shù)將納米HAp和CS制備成微米級微球支架，并通過一系列細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)評估其作為組織工程支架的生物學(xué)作用。

1　材料與方法

1．1材料及設(shè)備

1．1．1實(shí)驗(yàn)動物與試劑SPF級雄性4周齡SD大鼠20只，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。微球制備相關(guān)試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），高糖型DMEM（美國Invitrogen公司），胎牛血清（FBS）（中國四季青公司），異硫氰酸標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽（FITC-Phalloidin）、DAPI（美國Sigma公司），瓊脂糖（美國Solarbio公司）。

1．1．2主要儀器微量進(jìn)樣泵（中國蘭格恒流泵有限公司），pH計（PHS-3B，中國上海虹益公司），Countstar自動細(xì)胞計數(shù)儀（IC 1000，中國上海睿鈺生物科技有限公司），熒光倒置顯微鏡（DMI3000B，德國Leica公司），場發(fā)射掃描電子顯微鏡（JSM-6700F，日本JEOL電子公司），共聚焦掃描式顯微鏡（SP5-DMI6000-DIC，德國Leica公司）。

1．2方法

1．2．1HAp納米顆粒合成5 mmol尿素溶于20 m l乙醇與水（3∶1）混合溶液中，加入CaCl2（0．1 mol／L，8．35 ml）與NaH2PO4（0．1 mol／L，5 m l），pH值調(diào)至11．9。攪拌30 min，置于80℃烘箱24 h。產(chǎn)物洗滌凍干備用。

1．2．2復(fù)合微球制備及顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察CS及HAp各40 mg加入19．6 ml蒸餾水中，超聲破碎20 min，所得HAp-CS混合溶液作為內(nèi)相，環(huán)己烷溶液（含3%司班80）作為擠出相。利用微量進(jìn)樣泵控制兩相擠出速度，外向1 ml／min，內(nèi)相0．05 ml／min，進(jìn)行微球制備，NaOH乙醇溶液（0．4 mol／L）進(jìn)行收集固化，所得HAp-CS復(fù)合微球蒸餾水反復(fù)清洗，顯微鏡下觀察微球形態(tài)。

1．2．4細(xì)胞黏附率及增殖率微球高溫高壓滅菌了，與P2代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體外共培養(yǎng)。黏附率：細(xì)胞與微球復(fù)合之比為50∶1（細(xì)胞初始濃度為C0＝5×104／m l）。設(shè)置3個復(fù)管，置于培養(yǎng)搖床上，先動態(tài)培養(yǎng)5 min，后靜置30min，交替進(jìn)行6 h。1、2、3、4、5、6 h等6個時間點(diǎn)，分別吸取1 m l細(xì)胞微球混合溶液，靜置1 min，上清液中的游離細(xì)胞計數(shù)為Ct，黏附率為（C0-Ct）／C0×100% 。取3個復(fù)管平均值。增殖率：前6 h動靜態(tài)交替培養(yǎng)操作同上，設(shè)置3個復(fù)管。1、3、6、9 d時，取1 ml細(xì)胞微球混懸液，靜置后吸除上清液，PBS清洗3次，胰酶消化，定容至1 ml，細(xì)胞和微球均計數(shù)，細(xì)胞濃度為C，每毫升微球數(shù)為N，二者之比為C／N，該數(shù)值隨時間的增長體現(xiàn)了細(xì)胞在微球上的增殖。3個復(fù)管所得值求平均數(shù)。

1．2．5掃描電鏡觀察BMSCs與微球支架的復(fù)合狀態(tài)細(xì)胞材料復(fù)合1、3、6、9 d后，每種材料各取1 m l細(xì)胞材料混懸液，PBS清洗3次，2．5%戊二醛室溫固定30 min，冷凍干燥后進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1．2．6細(xì)胞骨架染色及共聚焦掃描式顯微鏡觀察

細(xì)胞材料復(fù)合后6 d，取1 ml細(xì)胞材料混懸液，PBS輕緩清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗（5 min×3）。FITC-Phalloidin（5μg／m l）避光染色40 min。PBS清洗10 min，清洗3次。DAPI（1μg／ml）避光染5 min。PBS洗3次。共聚焦掃描式顯微鏡觀察。

1．2．7體外模具實(shí)驗(yàn)6 cm培養(yǎng)皿中加入5 ml高溫高壓滅菌的2%瓊脂糖后，其厚度為2 mm。待其凝固后，使用直徑為5 mm的打孔器，瓊脂糖上便形成直徑為5 mm、厚度為2 mm的圓形缺損，與標(biāo)準(zhǔn)骨缺損尺寸吻合。將細(xì)胞和微球共培養(yǎng)1 d后填充至上述模具中，表面蓋篩網(wǎng)，加入5 ml培養(yǎng)液，每2 ～3 d換一次液，培養(yǎng)14～21 d，觀察組織塊形成情況。

2　結(jié)果

2．1顯微鏡下微球形態(tài)觀察將所制備的HAp-CS復(fù)合微球分散在水中，顯微鏡下可見其表面光滑，粒徑均勻，大小為300μm左右，見圖1。

2.2BMSCs黏附率和增殖率BMSCs與細(xì)胞復(fù)合前6 h的黏附率一直處于上升趨勢，2 h時已高達(dá)70%以上，6 h時，黏附率超過90%，說明HAp-CS微球具有良好的促細(xì)胞黏附作用，見圖2A。細(xì)胞與微球復(fù)合前3 d，增殖幅度較平緩，6 d時，達(dá)增殖高峰，與初始細(xì)胞微球復(fù)合之比（50∶1）相比，增長了10倍，第9天時，細(xì)胞處于凋亡期，見圖2B。

2.3BMSCs與細(xì)胞復(fù)合后掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞材料復(fù)合1 d后，少量BMSCs定植于微球表面，細(xì)胞緊密黏附于球體表面，長梭形似成纖維細(xì)胞，形態(tài)舒展，細(xì)胞之間有相互接觸融合的趨勢，見圖4A。細(xì)胞材料復(fù)合6 d后，大量細(xì)胞分布于微球上，微球間胞外基質(zhì)相互交織呈拉絲狀，并將微球纏繞包裹成一個團(tuán)塊。微球借細(xì)胞及胞外基質(zhì)凝聚成3D塊狀結(jié)構(gòu)，見圖3B。

2.4BMSCs骨架染色后熒光倒置顯微鏡及共聚焦掃描式顯微鏡觀察FTTC熒光素標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽與微絲結(jié)合后被熒光激發(fā)呈綠色，DAPI復(fù)染可將細(xì)胞核染成藍(lán)色，見圖4。熒光倒置顯微鏡下，BMSCs的胞核染成藍(lán)色，大量細(xì)胞黏附定植于微球表面。部分微球之間有大量細(xì)胞聚集，并借細(xì)胞連接在一起，見圖4A。共聚焦掃描顯微鏡下，微絲骨架呈綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，大量BMSCs定植并沿微球表面分布，骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核清晰可見，見圖4B。放大可見微絲呈長梭形放射狀包繞在胞核周圍，見4C。HAp-CS支架維持了細(xì)胞的特征性骨架結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的生長狀態(tài)良好。

2．5體外模具實(shí)驗(yàn)BMSCs和微球支架體外培養(yǎng)18 d，形成了復(fù)合組織塊。該塊狀結(jié)構(gòu)形態(tài)較規(guī)則完整，直徑約為5 mm，厚度約為2 mm，見圖5A。用鑷子夾起后，并無明顯擠壓變形或破裂，組織塊有一定凝聚力和抗重力作用，見圖5B。

3　討論

3．1微球制備工藝傳統(tǒng)塊狀陶瓷支架存在的最大問題是內(nèi)部細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)不足以及代謝廢物不能有效排出，嚴(yán)重影響骨修復(fù)的效果［4-5］。為此，研究者設(shè)計了一種新的思路，即利用微球支架作為靶細(xì)胞的黏附載體，直接復(fù)合細(xì)胞填補(bǔ)到組織缺損區(qū)或與靶細(xì)胞體外共培養(yǎng)成組織塊后移植于缺損區(qū)用于體內(nèi)修復(fù)［6］。微球材料的傳統(tǒng)制備方法主要有4種：乳化交聯(lián)法、沉淀凝聚法、溶劑蒸發(fā)法、噴霧干燥法［7-10］。但這類微球并不適于組織修復(fù)：乳化交聯(lián)法制備的微球粒徑不均勻，其所用化學(xué)交聯(lián)劑還具有一定生物毒性；噴霧干燥法所得微球粒徑較小且結(jié)構(gòu)過于致密，不適于細(xì)胞的黏附生長。本研究中采用的微流控制備技術(shù)，憑借其高通量、低消耗、精確的粒徑及結(jié)構(gòu)可控性等技術(shù)優(yōu)勢，在生命科學(xué)領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用價值［11-12］。

3．2支架對細(xì)胞的生物學(xué)作用一個理想的骨組織工程支架，必定能與細(xì)胞產(chǎn)生充分的生物學(xué)作用。支架材料已經(jīng)從簡單的機(jī)械支持成為能夠?yàn)檎T導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)控細(xì)胞生長增殖的生物學(xué)界面［1］。在仿生支架中引入納米級元素，可對成骨細(xì)胞和BMSCs產(chǎn)生多層次的調(diào)控，如黏附、存活、增殖以及信號基因的表達(dá)［2，13］。而本研究中HAp-CS支架的主要原料之一便是納米級HAp，黏附增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，其在BMSCs的初期定植和增殖生長方面具有明顯的優(yōu)勢。

微球支架與種子細(xì)胞間的相互作用在體外長期培養(yǎng)過程中得到了充分體現(xiàn)。一方面，HAp-CS球體間無額外作用力，無法自動凝聚成塊狀結(jié)構(gòu)，故球體間的連接需依靠BMSCs分泌的大量胞外基質(zhì)，這種天然“粘接劑”加強(qiáng)了細(xì)胞與微球間以及微球自身間的緊密聯(lián)系，并形成能抵御一定外力的工程化組織塊。另一方面，BMSCs的生理活動如長期存活和分泌胞外基質(zhì)等，又有賴于微球提供的結(jié)構(gòu)和生理支持。在體外長期培養(yǎng)的過程中，HAp-CS微球和BMSCs成為了相互作用的整體，這種3D塊狀結(jié)構(gòu)有望用于體內(nèi)骨再生的實(shí)驗(yàn)研究。

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Fabrication of hydroxyapatite-chitosan com positem icrospheres and their biological effect study in vitro

Shen Lili，He Jiacai
（1Stomatological Hospital＆College，2Anhui Medical University，3Key Lab．of Oral Diseases Research of Anhui Province，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the influence of HAp-CS composite microsphere scaffold on the in vitro cell behaviors ofmesenchymal cells and evaluate its potential application for bone tissue engineering．MethodsNanohydroxyap-atite（HAp）and chitosan（CS）composites solution were assembled into microsphere scaffold through microfluidic and observed by inverted microscope．Rat bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured in vitro with themicrospheres for calculating the adhesion rate for the first6h．Proliferation rate wasmeasured by cell counting in the next1，3，6，9 d，respectively，and GraphPad Prism 6 software was used for statistical analysis．The morphology of BMSCs on the surface of HAp-CS compositemicrosphere was observed by scanning electron microscopy（SEM）and confocal scanningmicroscopy．The cells and HAp-CSmicrospheres were filled into a disc mold and co-cultured for 14～21 d to observe the morphology．Resu ltsHAp-CS microspheres were observed to be round and with uniform size bymicroscope．The adhesion rate of BMSCs reached 80%after cultured for 6 h，and proliferation rate reached the highest value when cultured for 6 d．SEM observations showed that BMSCs adhered compactly to the surface of themicrospheres，and themicrospheres could be connected together through BMSCs．After co-culturing BMSCswithmicrospheres for14～21 d，a complete tissue constructs could be formed．Conclusion HAp-CSmicrospheres are proved to be good scaffolds for promoting BMSCs adhesion and proliferation．Large amount of extracellular matrix can be formed to connect microspheres after co-cultured for a certain time，which paves the way for HAp-CSmicrospheres to be applied for bone regeneration in animal experiments．

Key wordshydroxyapatite／chitosan microsphere；biomimetic scaffolds；bone mesenchymal stem cells；adhesion；proliferation

中圖分類號R 783．1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1552-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81371114）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MKL29）；安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：KJ2013A154）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，3安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室，合肥230032

作者簡介：沈麗麗，女，碩士研究生；