張美華+余衛(wèi)+王巧瑜+溫凌+蕭間開+潘潔

【摘要】 目的 比較經(jīng)腹腔注射與經(jīng)尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞治療大鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效。方法 選取10只體重約80 g的雄性清潔級SD大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）培養(yǎng)。另選取體重220～250 g的成年大鼠60只作為研究對象， 用于肝衰竭模型制備以及BMSCs輸注治療。將其中15只大鼠作為空白對照組， 剩下的45只均給予白毒傘粗毒素灌胃制備肝衰竭模型， 將造模成功的大鼠隨機均分為3組， 即肝衰竭模型組、經(jīng)腹腔注射治療組及經(jīng)尾靜脈注射治療組。對兩治療組予BMSCs經(jīng)兩種途徑輸注治療， 對比各組大鼠7 d生存率及肝功能、凝血功能、炎癥因子等指標情況。

結(jié)果 與肝衰竭模型組相比， 兩治療組SD大鼠體重減輕明顯更少（P<0.05）， 7 d生存率要明顯更高[73.3%、80.0% VS 20.0%]（P<0.05）， 兩治療組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療后兩治療組大鼠肝功能、凝血功能、炎癥因子等指標均較肝衰竭模型組顯著改善（P<0.05）， 兩治療組上述指標比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， 空白對照組大鼠肝功能、凝血功能、炎癥因子等指標與其他三組比較， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 經(jīng)腹腔注射和經(jīng)尾靜脈注射兩種輸注途徑骨髓間充質(zhì)干細胞對白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠具有十分明顯的治療作用， 能顯著改善大鼠肝功能衰竭， 且效果相當(dāng)。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細胞；白毒傘；急性肝衰竭；療效；輸注途徑

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.192

白毒傘（amanita verna）為劇毒蘑菇， 近年來廣東地區(qū)頻頻發(fā)生因誤食白毒傘而中毒死亡的事件。白毒傘鵝膏毒肽主要損害肝臟， 其中毒致急性肝衰竭死亡率>95%， 危害極大。白毒傘中毒致急性肝衰竭（AALF）發(fā)病兇猛， 臨床癥狀復(fù)雜， 治療難度較大， 至今仍是醫(yī)學(xué)界的難題之一[1]。目前國內(nèi)外仍然缺乏對白毒傘中毒致急性肝衰竭的有效治療手段， 而隨著醫(yī)學(xué)界對干細胞研究的逐漸深入， 應(yīng)用干細胞對急性肝衰竭的治療已經(jīng)得到了迅速的發(fā)展。本研究以此為背景， 比較經(jīng)腹腔注射與經(jīng)尾靜脈注射兩種不同輸注途徑骨髓間充質(zhì)干細胞治療大鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效， 旨在為選擇合理的輸注途徑提供參考， 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 選取10只體重約80 g的雄性清潔級SD大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的培養(yǎng)。另選取體重220～250 g的SD大鼠60只作為研究對象， 用于模型制備以及BMSCs輸注治療。實驗動物由廣州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供， 實驗過程中對動物的處置符合科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。將其中15只大鼠作為空白對照組， 另外45只均給予白毒傘粗毒素灌胃制備肝衰竭模型， 將造模成功的大鼠隨機分為肝衰竭模型組、經(jīng)腹腔注射治療組及經(jīng)尾靜脈注射治療組， 各15只。

1. 2 儀器與試劑 主要試劑包括DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（四季清公司）、胰蛋白酶（寶泰克公司）、PBS緩沖液（自制）。主要儀器包括超凈工作臺、恒溫細胞培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、離心機、水浴箱、低溫冰箱等。

1. 3 BMSCs的制備 將所選取用于制備 BMSCs的大鼠斷頸處死， 取其股骨， 無菌條件下采集大鼠骨髓液， 采用密度梯度離心法[2]， 反復(fù)貼壁分離純化BMSCs?？鼓撬铇吮局糜赑ercoll分離液梯度離心， 吸取中間單個核細胞（MNC）白膜層， 以1×106/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶， 培養(yǎng)體系為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基， 置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后換液， 之后每隔3～4 d換液1次， 取出懸浮細胞后， BMSCs將不斷純化。當(dāng)細胞生長融合達到80%～90%時， 用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化分散的細胞。此時將細胞標記為P1代， 以后每隔3～4 d換液1次， 當(dāng)細胞生長融合達到80%～90%的時候， 繼續(xù)以1∶3的密度傳代擴增培養(yǎng)， 取第3代BMSCs細胞制成單細胞懸液， 將細胞濃度調(diào)整為1×106/ml備用。

1. 4 白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠模型制備及治療 參照預(yù)實驗結(jié)果， 分別對45例實驗大鼠給予白毒傘粗毒素0.5 mg/kg劑量灌胃1次， 48 h后即可制備穩(wěn)定的白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠動物模型。造模成功后通過腹腔注射和經(jīng)尾靜脈注射對兩治療組大鼠實施BMSCs的輸注治療， 共3次， 1次/d， 細胞數(shù)量1×106/（kg·次）。

1. 5 觀察指標 ①SD大鼠的生存情況、體重變化情況；②治療結(jié)束各組大鼠采尾靜脈血檢測肝功能及凝血功能；③治療結(jié)束采尾靜脈血測定血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL-6）等炎癥因子含量， 評價實驗SD大鼠系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)情況。

1. 6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 肝衰竭模型組與兩治療組大鼠生存及體重情況比較 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 與肝衰竭模型組比較， 治療結(jié)束后兩治療組大鼠體重減輕明顯更少（P<0.05）， 7 d生存率明顯更高（P<0.05）；經(jīng)腹腔注射治療組與經(jīng)尾靜脈注射治療組體重減輕及7 d生存率比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2. 2 各組大鼠肝功能指標比較 治療后采血行肝功能檢查， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與肝衰竭模型組比較， 兩治療組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）明顯降低（P<0.05）， 白蛋白（ALB）明顯升高（P<0.05）；兩治療組ALT、AST、TBIL、ALB比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?？瞻讓φ战MALT、AST、TBIL與其他三組比較明顯降低， ALB明顯升高， 比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 各組大鼠凝血功能指標和炎癥因子數(shù)量比較 治療后采血檢測炎癥因子和凝血功能， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與肝衰竭模型組比較， 兩治療組大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）明顯降低（P<0.05）；兩治療組TNF-α、IL-6、PT、APTT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）?？瞻讓φ战MTNF-α、IL-6、PT、APTT與其他三組比較明顯降低， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

白毒傘為劇毒蘑菇， 近年來廣東地區(qū)頻頻發(fā)生因誤食白毒傘而中毒死亡的事件。誤采、誤食野生蕈中毒事件中， 95%是由鵝膏蕈所致。鵝膏毒肽是鵝膏蕈所含的最重要致死毒素， 鵝膏毒肽能溶于水， 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定， 耐高溫和酸堿。食入后， 可迅速被消化道吸收進入肝臟， 并能迅速與肝細胞RNA聚合酶結(jié)合， 抑制mRNA的生成， 造成肝細胞壞死， 導(dǎo)致急性肝功能衰竭[3]， 嚴重危害人類的健康。而急性肝衰竭能否逆轉(zhuǎn)主要取決于患者受損肝細胞的壞死程度以及殘留肝細胞的再生能力， 因此阻斷肝細胞壞死， 促進肝細胞再生是決定治療是否成功的必要條件。

近年來， 隨著干細胞研究的不斷深入， 干細胞移植在肝臟疾病的治療中也更受重視。骨髓間充質(zhì)干細胞是成體干細胞的一種， 是中胚層發(fā)育的早期細胞。BMSCs不但能夠與其他細胞一起支持造血干細胞的造血， 還能夠在不同的誘導(dǎo)條件下分化成多種組織細胞， 這也使得BMSCs成為組織工程、細胞以及基因治療最為理想的靶細胞[4]。BMSCs具有十分強的定向分化能力， 具有自體移植不排斥的優(yōu)點， 在異基因移植中也能夠長期存活并保持其正常的生物學(xué)功能。此外， BMSCs的來源非常廣泛， 其具有采集、制備程序簡單、分化能力強、性能穩(wěn)定、可重復(fù)性好等優(yōu)點。研究表明BMSCs具有向肝細胞分化的能力， 體外細胞因子誘導(dǎo)及體內(nèi)實驗都證明BMSCs可以分化成肝細胞或肝樣細胞[5， 6]。另有實驗證明BMSCs在肝臟病理條件下能夠分化為具有部分生理功能的類肝樣細胞， 向具有正常功能的肝細胞進行轉(zhuǎn)化， 并參與修復(fù)損傷的肝臟， 發(fā)揮合成、解毒、代謝等功能， 對肝衰竭有顯著的治療作用， 降低肝衰竭的死亡率[7， 8]。這些研究結(jié)果為進一步開展BMSCs輸注治療終末期肝病創(chuàng)造了條件， 為白毒傘中毒致急性肝衰竭患者的治療帶來了新希望。有研究表明， 經(jīng)腹腔注射BMSCs較經(jīng)尾靜脈注射成功率更高[9]。但經(jīng)尾靜脈注射可直接進入血液， 藥物吸收快。因此， 兩種輸注途徑注射骨髓間充質(zhì)干細胞治療鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭的療效有待通過實驗進行探討。

本實驗利用白毒傘粗毒素灌胃制備大鼠白毒傘中毒致急性肝衰竭模型， 分別通過腹腔注射和尾靜脈注射途徑予骨髓間充質(zhì)干細胞輸注治療。研究結(jié)果顯示， 進行經(jīng)腹腔和尾靜脈注射BMSCs移植治療均能夠顯著提高AALF大鼠的一般生存情況和生存率， 顯著改善AALF大鼠肝功能、凝血功能以及炎癥反應(yīng)情況， 且效果相當(dāng)， 提示采用兩種途徑輸注BMSCs治療對白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠均具有十分顯著的療效。這直接說明了所移植的BMSCs能夠在急性肝衰竭的大鼠肝臟中轉(zhuǎn)化為具有正常生物學(xué)功能的肝細胞。因此， 采用腹腔和尾靜脈注射移植BMSCs治療急性肝衰竭都是可行有效的[10， 11]。

綜上所述， 采用經(jīng)腹腔和尾靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細胞治療對白毒傘中毒致急性肝衰竭大鼠均具有十分顯著的療效， 能顯著改善大鼠肝功能衰竭情況， 提高生存率。如果經(jīng)上述兩種途徑輸注骨髓間充質(zhì)干細胞治療運用于臨床白毒傘中毒患者， 將為廣大因誤食白毒傘而中毒致急性肝衰竭的患者帶來巨大的福音。

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[收稿日期：2016-03-25]