董亞賢+堯慧燕+梁兵+鐘高賢+刁芳明+石紅婷

【摘要】 目的 比較不同靶向納米材料作為基因載體的細胞毒性大小及其轉(zhuǎn)染效率。方法 以聚乙烯亞胺（PEI）為對照， 化學合成髓鞘堿性蛋白68-86（MBP68-86）-多聚賴氨酸（PLL）-聚乙烯亞胺-聚乙二醇（PEG）接枝支化特異性配體乳鐵蛋白 （Lf）及PLL-PEI-PEG， 并采用MTT法檢測細胞毒性， 倒置顯微鏡熒光觀察法和流式細胞儀法檢測轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf細胞毒性比PLL-PEI-PEG及PEI低， 三組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的轉(zhuǎn)染效率為（41.8±0.9）%；PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的轉(zhuǎn)染效率為（28.4±1.1）%；PEI/pAAV-EGFP 為的轉(zhuǎn)染效率（20.5±1.2）%， 兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG可作為基因轉(zhuǎn)染的傳輸載體， 其中MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf最好。

【關(guān)鍵詞】 納米材料； MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf；基因載體；PLL-PEI-PEG

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.20.193

目前所有的基因治療研究領(lǐng)域， 都存在轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染效率、定向性、可控性、安全性等方面的不足[1]。而納米載體憑借其低毒、高效負載等優(yōu)點在基因治療中發(fā)揮越來越重要的作用。作者前期實驗已經(jīng)成功合成并驗證了PLL-PEI-PEG[2] 。因此， 本文在前期實驗的基礎(chǔ)上合MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf， 并在體外比較不同新型靶向納米材料的細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率， 以篩選出更加高效、低毒和高靶向性的基因載體， 為神經(jīng)系統(tǒng)的基因治療帶來新的希望。

1 材料與方法

1. 1 細胞來源及培養(yǎng) 大鼠單個核細胞（PBMC）購自美國ATCC公司， 由本實驗室保存。采用加有10% 胎牛血清（FBS）和1%抗生素（青霉素/鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1. 2 PLL-PEI-PEG-Lf/MBP68-86的制備 MBP68-86用Traut試劑硫酸化后再與納米材料以分子比4∶1混合， 在室溫下反應(yīng)1h， 去除過剩的MBP68-86。

1. 3 質(zhì)粒DNA（pDNA）的制備 質(zhì)粒在大腸桿菌中擴增， 然后用質(zhì)粒提取試劑盒提取純化。得到的質(zhì)粒通過紫外分光光度計檢測其純度和濃度。檢測合格的質(zhì)粒保存于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/質(zhì)粒DNA復(fù)合物的制備 在Eppendorf管中， 將1 μg pDNA稀釋在50 μl不含F(xiàn)BS的DMEM中， 振蕩均勻， 按不同N/P比把相應(yīng)量的納米材料加入到另外一管裝有50 μl不含F(xiàn)BS的DMEM的Eppendorf管中， 然后把兩溶液在室溫下振蕩5min得到均勻復(fù)合物。

1. 5 細胞毒性 采用四唑鹽（MTT）比色法檢測細胞毒性， 具體方法參見文獻[2]。

1. 6 細胞轉(zhuǎn)染效率 采用倒置熒光顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染結(jié)果， 并采用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率， 具體轉(zhuǎn)染過程及檢測方法參見文獻[2]。

1. 7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 細胞毒性檢測結(jié)果 采用MTT檢測細胞毒性。當N/P<10時， 三種納米材料載體的細胞存活率都>80%；在N/P=15時， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP為78%， PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP為63%， 比PEI/pAAV-EGFP的細胞存活率（52%）要高， 兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；N/P<15時， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP和PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的存活率相當， 但兩者比PEI25kD/pAAV-

EGFP要高， 只是在N/P>15時MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP的細胞存活率才比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP低， 兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

納米材料形成復(fù)合物后在PBMC細胞中的細胞毒性。見圖1。

2. 2 細胞轉(zhuǎn)染效果

2. 2. 1 倒置熒光顯微鏡觀測細胞轉(zhuǎn)染效果 采用倒置熒光顯微鏡觀測細胞轉(zhuǎn)染效果， 發(fā)現(xiàn)在N/P=15時載體綠色熒光蛋白表達量最多， 同時MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的細胞熒光表達效果比PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP和PEI/pAAV-EGFP要好。

2. 2. 2 流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染效果 本實驗還利用流式細胞儀檢測了N/P=15時三種納米材料的轉(zhuǎn)染效率， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf/pAAV-EGFP 的轉(zhuǎn)染效率為（41.8±0.9）%；PLL-PEI-PEG/pAAV-EGFP的轉(zhuǎn)染效率為（28.4±1.1）%；PEI/pAAV-EGFP 為的轉(zhuǎn)染效率（20.5±1.2）%， 兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

新型納米材料作為基因載體具有良好的安全性和生物相容性[3]。近來許多實驗[4， 5]通過改變陽離子聚合物的結(jié)構(gòu)或?qū)ζ溥M行化學修飾而降低毒性， 并實現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率。在以前的工作中， 作者已經(jīng)成功合成并驗證了靶向、高效及可降解型PLL-PEI-PEG基因載體， 并作了相關(guān)的報道[2]。由于乳鐵蛋白（Lf）可通過受體介導的跨細胞轉(zhuǎn)運通過血腦屏障。考慮到這一點， 作者擬將Lf主要結(jié)構(gòu)序列連接到PEG末端， 從而使這種納米材料PLL-PEI-PEG-Lf可通過跨細胞轉(zhuǎn)運進入腦組織。雖因PLL-PEI-PEG-Lf可透過血腦屏障進入腦組織， 但對腦的不同組織并無特異性。因此本實驗在PEG的基礎(chǔ)上加以MBP68-86修飾， 使新的載體同時具備血腦屏障穿透性和活化的免疫細胞靶向性。

同樣用量的時候MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的毒性最低?；蜉d體除了應(yīng)具有較低的毒性， 較高的轉(zhuǎn)染效率也非常關(guān)鍵。MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf的轉(zhuǎn)染效果較PLL-PEI-PEG及PEI好， 另外流式細胞儀檢測也證實了同樣的結(jié)果。由此可以得出MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作為基因傳輸載體較好。

綜上所述， MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf和PLL-PEI-PEG都可作為基因傳輸?shù)妮d體， 但由于MBP68-86-PLL-PEI-PEG-Lf作為PLL-PEI-PEG的改進品， 各方面的性能都優(yōu)于PLL-PEI-PEG， 因此具有更高的可塑性和價值。

參考文獻

[1] 梁兵， 袁芳， 楊寧， 等. 3種不同類型基因?qū)胂到y(tǒng)轉(zhuǎn)染類神經(jīng)元細胞的效率比較.重慶醫(yī)學， 2012， 41（18）：1792-1798.

[2] 董亞賢， 石紅婷， 梁兵， 等. 新型靶向納米材料作為基因載體的評估. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學， 2015， 42（13）：2405-2408.

[3] 梁兵， 袁芳， 殷建瑞， 等. 納米材料PEG-PEI介導雙基因促體外擬神經(jīng)細胞凋亡的作用. 山東醫(yī)藥， 2012， 52（25）：1-4.

[4] 謝黎崖， 胡權(quán)， 吳永良， 等.葉酸和聚乙二醇雙修飾的殼聚糖納米粒的制備及其性能表征.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學， 2013， 30（3）：284-289.

[5] 劉文文， 王曉梅， 趙永波， 等.重組大鼠質(zhì)粒pEGFP-GDNF的構(gòu)建及真核細胞轉(zhuǎn)染.中風與神經(jīng)疾病雜志， 2005， 22（2）：104-106.

[收稿日期：2016-03-31]