張叢叢 陳彩霞 陳笑 溫雅 晏禮明 陶勇

（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

全細(xì)胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究進(jìn)展

張叢叢 陳彩霞 陳笑 溫雅 晏禮明 陶勇

（中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101）

N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetyl-D-neuraminic acid，Neu5Ac）及其衍生物不僅在人體內(nèi)發(fā)揮重要的生理生化功能，且已經(jīng)應(yīng)用到流感的預(yù)防和治療。但已有的N-乙酰神經(jīng)氨酸生產(chǎn)方法產(chǎn)量低、成本高，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及糖組學(xué)研究的發(fā)展與成熟，一種新型的生物技術(shù)即全細(xì)胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸正成為研究的熱點(diǎn)。旨在介紹全細(xì)胞催化技術(shù)合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究進(jìn)展。

N-乙酰神經(jīng)氨酸；唾液酸；全細(xì)胞催化法；生物轉(zhuǎn)化

唾液酸（Sialic acid，SA）是一類Neu5Ac的O-乙酰基衍生物［1］，在微生物及哺乳動(dòng)物體內(nèi)大量存在［2］。迄今，分離鑒定的唾液酸類化合物已有40多種［3］，其中Neu5Ac約占整個(gè)唾液酸家族的99%以上［4，5］。少以游離形式存在，多連接在細(xì)胞膜表面的糖蛋白、糖脂或寡糖末端［6］。Neu5Ac是細(xì)胞信息傳遞的第一接觸位點(diǎn)［7］，且其分子結(jié)構(gòu)具有多樣性，因此Neu5Ac參與細(xì)胞識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、受精等多個(gè)生理過(guò)程［8-12］。此外，Neu5Ac能調(diào)節(jié)IgG的抗炎活性，增強(qiáng)嬰兒免疫力，影響神經(jīng)細(xì)胞的完整性、滲透性及活性，促進(jìn)嬰兒大腦的發(fā)育［13-16］。以唾液酸為主體結(jié)構(gòu)的一系列藥物已被用于癌癥、炎癥及流感的治療［17，18］。但現(xiàn)有生產(chǎn)方法產(chǎn)量低、成本高，難以滿足市場(chǎng)需求，因而建立經(jīng)濟(jì)高效的生產(chǎn)方法成為研究熱點(diǎn)。

目前制備Neu5Ac的方法主要有：天然原料提取法、化學(xué)合成法、酶促合成法、生物轉(zhuǎn)化法及微生物發(fā)酵法等。19世紀(jì)60年代以來(lái)，研究者相繼從牛初乳、卵黃、酪蛋白和燕窩等SA含量相對(duì)豐富的天然材料中提取Neu5Ac［19-22］。但SA在天然原料中總含量低、分離提純過(guò)程復(fù)雜，導(dǎo)致其收率低、成本高、產(chǎn)物立體選擇性較差，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法多是在堿性或酸性條件下，由多種底物在催化劑的催化下合成，整個(gè)過(guò)程既需高溫、高壓等嚴(yán)苛的反應(yīng)條件、復(fù)雜的生產(chǎn)工藝，還涉及復(fù)雜的基團(tuán)保護(hù)、去保護(hù)問(wèn)題；且反應(yīng)過(guò)程中生成較多的中間產(chǎn)物及異構(gòu)體，使產(chǎn)物后處理極其繁瑣，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求［23-27］。此外，Neu5Ac還可通過(guò)水解微生物發(fā)酵的聚唾液酸得到。但此法產(chǎn)物濃度低，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，多伴有副產(chǎn)物，僅限于小規(guī)模試驗(yàn)。生物合成法反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、后處理簡(jiǎn)單、專一性好、產(chǎn)品純度高，已逐漸取代傳統(tǒng)工藝成為新型“綠色”生產(chǎn)技術(shù)。隨著代謝工程、基因工程手段的發(fā)展，與基因工程技術(shù)相結(jié)合的全細(xì)胞催化法（whole-cell biocatalysis），已成為大規(guī)模生產(chǎn)Neu5Ac的最理想途徑。因此，本文將重點(diǎn)介紹近年來(lái)全細(xì)胞催化法生產(chǎn)Neu5Ac的研究進(jìn)展。

1 全細(xì)胞催化法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸

全細(xì)胞催化法的基本原理是利用完整的生物有機(jī)體作為催化劑進(jìn)行化學(xué)轉(zhuǎn)化，將某種前體分子轉(zhuǎn)化成特定產(chǎn)物，其實(shí)質(zhì)是利用生物體系中酶的催化作用［28］。該方法主要是利用代謝工程原理，結(jié)合基因工程手段，對(duì)Neu5Ac代謝途徑進(jìn)行改造進(jìn)而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的大量合成。主要手段包括在宿主細(xì)胞中過(guò)表達(dá)合成途徑中的相關(guān)酶蛋白，或敲除其降解途徑的相關(guān)酶基因，解除產(chǎn)物的反饋抑制。而該方法的主要依據(jù)是Neu5Ac在生物體內(nèi)的多種合成途徑（圖1）。

圖1 Neu5Ac的生物合成途徑［29-32］

全細(xì)胞催化法合成Neu5Ac得以實(shí)現(xiàn)首先歸功于1986年Aisaka等的工作，他們首次從E.coli中克隆并表達(dá)出N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶（N-Acetylneuraminic acid aldolase，NanA），揭開(kāi)了全細(xì)胞催化法生產(chǎn)Neu5Ac的序幕。隨后，研究者相繼從多殺巴斯德桿菌病（Pasteurella multocida）、Bacteroides ovatus ATCC 8483中分別克隆出NanA、N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶（GlcNAc 2-epimerase）［33-36］，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了較全面的研究，促使全細(xì)胞催化技術(shù)不斷發(fā)展并日益成熟。迄今，全細(xì)胞催化技術(shù)經(jīng)歷了多細(xì)胞偶聯(lián)和單細(xì)胞合成兩個(gè)階段。

1.1 雙細(xì)胞及多細(xì)胞偶聯(lián)系統(tǒng)

Tabata等［37］創(chuàng)造性地將全細(xì)胞催化法應(yīng)用于Neu5Ac的合成。他們以E. coli NM522為宿主菌，分別克隆并過(guò)表達(dá)單細(xì)胞集胞藻（Synechocystis sp. PCC6803）的N-乙酰葡萄糖胺異構(gòu)酶基因（slr1975）、大腸桿菌（E.coli K-1）的Neu5Ac合酶基因（neuB），同時(shí)偶聯(lián)產(chǎn)氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes）并利用其代謝過(guò)程中產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），共同合成Neu5Ac，構(gòu)建了一個(gè)新型的微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖2）。該方法以800 mmol/L N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）和360 mmol/L葡萄糖作為起始反應(yīng)體系，反應(yīng)22 h后產(chǎn)生39.7 mmol/L（12.3 g/L） Neu5Ac，GlcNAc轉(zhuǎn)化率為5%。

雖然產(chǎn)物的產(chǎn)量較低，但這是首次在原核生物中克隆并表達(dá)出slr1975，為日后的研究工作提供了新思路。這種方法最大優(yōu)點(diǎn)是利用工程菌的胞內(nèi)酶，使整個(gè)反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)完成，前體物質(zhì)GlcNAc經(jīng)異源表達(dá)的專一性酶催化生成目標(biāo)產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該方法有效提高了合成效率，避免了繁瑣的酶純化過(guò)程，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，節(jié)省了ATP的添加成本，為工業(yè)化生產(chǎn)Neu5Ac提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖2 多細(xì)胞偶聯(lián)催化合成Neu5Ac［37］

2007年，Xu等［38］提出了化學(xué)合成法與生物轉(zhuǎn)化法相結(jié)合的新方法。該方法綜合了細(xì)菌氧化乳酸生成丙酮酸的反應(yīng)專一性與化學(xué)異構(gòu)化合成ManNAc的高效性，建立了一種高效、經(jīng)濟(jì)的復(fù)合式轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其利用E.coli K-12 的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶基因（nanA）與E. coli BL21構(gòu)建了重組菌E. coli BL21（DE3）/pET15b-nanA，并與施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri SDM）相偶聯(lián)，形成雙細(xì)胞偶聯(lián)系統(tǒng)。施氏假單胞菌的乳酸氧化酶復(fù)合物（lactate oxidase，LOX）專一性地催化乳酸生成丙酮酸［39］，與化學(xué)異構(gòu)化得到的ManNAc在重組細(xì)胞內(nèi)協(xié)同合成Neu5Ac（圖3）。結(jié)果顯示，223.18 g/L GlcNAc及65.61 g/L乳酸生成18.32 g/L Neu5Ac，產(chǎn)量比Tabata等的研究結(jié)果提高了約50%，同時(shí)提高了GlcNAc的轉(zhuǎn)化效率，達(dá)到6%。

該方法的優(yōu)點(diǎn)在于將化學(xué)合成與生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合，一方面利用化學(xué)合成法高效快速地異構(gòu)化GlcNAc產(chǎn)生高濃度的ManNAc，促使可逆反應(yīng)向生成Neu5Ac的方向進(jìn)行，提高了GlcNAc的轉(zhuǎn)化效率；另一方面，在重組菌中表達(dá)的NanA比E.coli K-12中的活性高約56倍，極大地提高了酶活性，有效提高了生物合成效率。而且生物轉(zhuǎn)化法能夠減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使反應(yīng)易于控制與操作。對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)，用低價(jià)的乳酸取代丙酮酸作為底物，極大地降低了生產(chǎn)成本。

圖3 化學(xué)合成法與雙細(xì)胞偶聯(lián)法相結(jié)合生成Neu5Ac［38］

同年，Lee等［40］研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)腥藻屬（Anabaena sp. CH1）的N-乙酰葡糖胺異構(gòu)酶（bGlcNAc 2-epimerase，bage）活性比豬腎的N-乙酰葡糖胺異構(gòu)酶（pGlcNAc 2-epimerase，page）高11.5倍。因此構(gòu)建工程菌時(shí)，他們將bage和E. coli K-1的nanA，分別導(dǎo)入宿主菌E. coli BL21，構(gòu)建了兩株重組 菌E. coli BL21（DE3）/pET-bage及E. coli BL21（DE3）/pET-nanA，形成雙細(xì)胞偶聯(lián)的微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖4）［41］。由1 200 mmol/L GlcNAc和1 200 mmol/L丙酮酸作為初始反應(yīng)體系，轉(zhuǎn)化12 h后，產(chǎn)物Neu5Ac終濃度高達(dá)122.3 g/L，生成速率為10.2 g/L/h，GlcNAc轉(zhuǎn)化效率達(dá)到33%。該方法的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化效率均較同期的全細(xì)胞催化法有大幅度的提高。該方法的另一個(gè)創(chuàng)新之處為該系統(tǒng)的工程菌細(xì)胞能循環(huán)使用8次，并且每個(gè)循環(huán)中Neu5Ac生成速率均維持在8.0 g/L/h以上。

該方法比較了不同的異構(gòu)酶基因活性，運(yùn)用高活性的異構(gòu)酶促進(jìn)了Neu5Ac產(chǎn)量顯著提高。同時(shí)，目標(biāo)產(chǎn)物的生成速率提高了近5倍。這為后期提高Neu5Ac產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)思路。更值得一提的是，該方法首次提出多次循環(huán)利用工程菌，縮短了生產(chǎn)周期，簡(jiǎn)化了操作工藝，降低了發(fā)酵成本，使工程菌得到了最大程度的利用。但該方法仍存在需改進(jìn)的工藝，其要求的底物濃度較高，較高的成本限制了工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 雙細(xì)胞偶聯(lián)法催化合成Neu5Ac［41］

2010年，Zhang等［42］在雙細(xì)胞偶聯(lián)法的基礎(chǔ)上，首次使用溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)取代化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)。以E. coli K12作為宿主菌，分別用溫度誘導(dǎo)載體pBV220克隆表達(dá)Synechocystis sp. PCC 6803的slr1975以及E. coli K-1的nanA，以丙酮酸和GlcNAc為前體物質(zhì)合成Neu5Ac。轉(zhuǎn)化36 h后，由200 mmol/L GlcNAc生成61.9 mmol/L（19.1 g/ L） Neu5Ac，轉(zhuǎn)化率達(dá)到30.95%（圖5）。雖然該方法的產(chǎn)量沒(méi)有明顯提高，但僅通過(guò)簡(jiǎn)單地提高溫度來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)相比于有毒性的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)更安全高效。該方法不僅保證了底物的高轉(zhuǎn)化率，也創(chuàng)新性提出了一種簡(jiǎn)便安全、經(jīng)濟(jì)有效的生產(chǎn)工藝，為安全化工業(yè)生產(chǎn)提供了有力的保障。

圖5 溫度誘導(dǎo)系統(tǒng)為特征的雙細(xì)胞偶聯(lián)法合成Neu5Ac［42］

微生物多細(xì)胞及雙細(xì)胞偶聯(lián)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的提出與發(fā)展，使得產(chǎn)量顯著提高，極大地推動(dòng)了實(shí)現(xiàn)Neu5Ac工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)程。在此基礎(chǔ)上，不斷有人對(duì)Neu5Ac的合成，包括宿主菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)、催化酶及供體基因進(jìn)行研究和優(yōu)化，使該工藝日臻完善，操作流程更簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件更溫和，生產(chǎn)工藝更環(huán)保，生產(chǎn)成本更低廉。但由于多細(xì)胞及雙細(xì)胞偶聯(lián)系統(tǒng)常需兩種及兩種以上細(xì)胞作為載體，一方面難以維持系統(tǒng)的平衡以及細(xì)胞間的協(xié)調(diào)；另一方面細(xì)胞間傳質(zhì)阻力會(huì)阻礙中間產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)，降低了底物利用率。此外，系統(tǒng)中的副反應(yīng)也在一定程度上降低Neu5Ac的產(chǎn)量。因此，為了克服細(xì)胞間的傳質(zhì)阻力、解決系統(tǒng)間的協(xié)調(diào)與平衡、提高底物利用率，嘗試將整個(gè)合成過(guò)程在單細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)成為研究者追求的目標(biāo)。

1.2 單細(xì)胞合成系統(tǒng)

2010年Ishikawa等［43］在前期工作的基礎(chǔ)上，首次實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞合成Neu5Ac技術(shù)（圖6）。將slr1975、neuB基因?qū)隕.coli構(gòu)建重組菌E.coli N18-14/pLT4K，使其具備異構(gòu)酶及合酶活性，從而在單細(xì)胞內(nèi)完成整個(gè)合成過(guò)程。這有效地避免了傳質(zhì)阻力引起的底物利用率降低。同時(shí)，敲除了nanA，使菌體喪失醛縮酶活性，防止Neu5Ac裂解。并且將工程菌用表面活性劑Nymeen S-215和甲苯處理，使之獲得高通透性，利于底物跟產(chǎn)物的胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)從而促進(jìn)反應(yīng)向合成方向進(jìn)行。在GlcNAc用量為540 mmol/L（120 g/L）的體系反應(yīng)22 h，產(chǎn)物濃度達(dá)172 mmol/L（53 g/L），產(chǎn)物生成速率為2.41 g/L/h，轉(zhuǎn)化率達(dá)32%。這是利用單細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)Neu5Ac的首創(chuàng)。

該技術(shù)與多細(xì)胞偶聯(lián)系統(tǒng)相比具有明顯優(yōu)勢(shì)：首先，該體系僅由一種工程菌組成，更利于系統(tǒng)內(nèi)的平衡與協(xié)調(diào)，也簡(jiǎn)化了工藝過(guò)程；其次，減少了底物及中間產(chǎn)物在細(xì)胞間的傳遞步驟，提高了底物利用率；三是，隨著底物利用率的增加，Neu5Ac的產(chǎn)量明顯提高；四是，代謝途徑的進(jìn)一步優(yōu)化，減少了合成過(guò)程中的副反應(yīng)，進(jìn)一步促進(jìn)了產(chǎn)物的積累；五是，應(yīng)用單細(xì)胞體系，便于菌體的分離及循環(huán)利用，簡(jiǎn)化了Neu5Ac的分離純化流程。另外，在反應(yīng)體系中添加表面活性劑以增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，為后期研究提供了新思路，但尋求更加安全合適的表面活性劑將是研究者進(jìn)一步探究的方向。

圖6 單細(xì)胞催化合成Neu5Ac［43］

2011年，Tao等［44］在前期工作基礎(chǔ)上結(jié)合單細(xì)胞合成法，進(jìn)一步優(yōu)化改造宿主菌的代謝途徑，建立了“one-pot”反應(yīng)系統(tǒng)。首先敲除編碼葡萄糖特異PTS轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因（nagE），使磷酸轉(zhuǎn)移酶活性喪失，因此GlcNAc能夠直接進(jìn)入Neu5Ac合成途徑。然后用溫度誘導(dǎo)載體pBV220將slr1975轉(zhuǎn)化到突變體E.coli K-12中，與nanA共表達(dá)，組成“one-pot”轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖7）。該方法以溴化十六烷三甲基銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）作為表面活性劑，使Neu5Ac產(chǎn)量提高了一倍多。結(jié)果顯示，該系統(tǒng)36 h 能產(chǎn)生191 mmol/L（59 g/L）的Neu5Ac，產(chǎn)物生成速率約1.64 g/L/h。

該方法在保障高產(chǎn)高轉(zhuǎn)化率的前提下，以溫度誘導(dǎo)型質(zhì)粒作為載體，以CTAB取代二甲苯作為表面活性劑，保證了生產(chǎn)過(guò)程的安全性。而且，由于大腸桿菌對(duì)CTAB的較高耐受性，能在一定程度上提高菌體效率，從而提高了整個(gè)系統(tǒng)的生產(chǎn)效率。

2012年，Kang等［45］在E. coli中 設(shè)計(jì)了一條以葡萄糖為唯一底物、以N-乙酰葡糖胺六磷酸（GlcNAc-6-P）為中間產(chǎn)物的Neu5Ac合成通路（圖8）。首先將Saccharomyces cerevisiae EBY100的葡萄糖-6-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（GNA1）、slr1975及nanA導(dǎo)入受體菌E. coli DH5α中共表達(dá)。同時(shí)過(guò)表達(dá)葡萄糖-6-磷酸合酶基因（glmS）解除其反饋抑制，并敲除nanE、nanK、nagA等基因以增加GlcNAc及ManNAc的積累；敲除丙酮酸在其他代謝途徑中的相關(guān)酶基因以保證丙酮酸完全進(jìn)入Neu5Ac合成途徑而不被降解；敲除Neu5Ac向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的基因nanT保證產(chǎn)物充分運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，促進(jìn)反應(yīng)向合成方向進(jìn)行。最初該工程菌直接利用葡萄糖可產(chǎn)生1.62 g/L Neu5Ac，后經(jīng)分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)7.85 g/L。

圖7 “one-pot”反應(yīng)系統(tǒng)［44］

該方法利用菌體自身的代謝途徑并加以改造，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為唯一底物合成Neu5Ac的愿景。雖然產(chǎn)量較低但用葡萄糖取代了GlcNAc、丙酮酸等高價(jià)的底物，極大地降低了生產(chǎn)成本，為開(kāi)發(fā)更加簡(jiǎn)潔高效的Neu5Ac合成途徑奠定了基礎(chǔ)。

圖8 以葡萄糖為底物的Neu5Ac合成途徑［45］

2013年，Sun等［32］研究了多順?lè)醋淤|(zhì)粒上Nal與anAGE基因順序?qū)eu5Ac產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明重組菌E. coli Rosetta（DE3） pLysS：pET-28a-Nal-anAGE合成的Neu5Ac產(chǎn)量最高。含0.8 mol/L GlcNAc與1.2 mol/L丙酮酸的反應(yīng)體系產(chǎn)生了61.3 g/L Neu5Ac。該研究創(chuàng)造性的提出了基因順序?qū)eu5Ac產(chǎn)量有影響并得到證實(shí)，為進(jìn)一步優(yōu)化合成途徑提供了一定理論依據(jù)。

關(guān)于全細(xì)胞催化法合成Neu5Ac的最新報(bào)道是本研究組在大量前期研究的基礎(chǔ)上提出的一個(gè)更簡(jiǎn)單高效的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（圖9）［46］。該系統(tǒng)以E. coli K-12為宿主菌，敲除nanTEK，導(dǎo)入age及nanA共表達(dá)，獲得重組菌E. coliΔ nanTEK/pNA。在此菌株中阻斷了Neu5Ac合成的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，保證ManNAc充分進(jìn)入Neu5Ac合成途徑，同時(shí)使Neu5Ac不斷運(yùn)出細(xì)胞促使反應(yīng)向合成方向進(jìn)行，結(jié)果0.6 mol/L GlcNAc 及0.8 mol/L丙酮酸的反應(yīng)體系生成74.2 g/L Neu5Ac，產(chǎn)物生成速率達(dá)到6.2 g/L/h，轉(zhuǎn)化率高達(dá)40%。并且菌體可以回收循環(huán)利用5次。

該系統(tǒng)Neu5Ac的產(chǎn)量及產(chǎn)物生產(chǎn)速率均是目前報(bào)道的單細(xì)胞合成法最高值。其利用較低的底物濃度，獲得較高的產(chǎn)物生成速率，成為目前合成Neu5Ac最為理想的方式，進(jìn)一步推動(dòng)了全細(xì)胞催化法合成Neu5Ac實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的進(jìn)程。

圖9 優(yōu)化后的Neu5Ac單細(xì)胞合成系統(tǒng)［46］

2 展望

在最近10多年中，依賴于基因工程與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，Neu5Ac的全細(xì)胞催化合成與應(yīng)用取得了引人矚目的成績(jī)和進(jìn)步，已成為合成Neu5Ac的最理想方式。全細(xì)胞催化法作為對(duì)環(huán)境友好，低投資的前瞻性工藝路線，與化學(xué)合成法相比，全細(xì)胞催化法應(yīng)用專一性的酶對(duì)前體物質(zhì)進(jìn)行專一性地酶促反應(yīng)，副產(chǎn)物少，且反應(yīng)條件溫和、污染低；與微生物發(fā)酵法相比，全細(xì)胞催化法生產(chǎn)周期更短，操作條件更容易控制，細(xì)胞或酶易再生、可循環(huán)使用，更適合大規(guī)模生產(chǎn)；與酶法合成相比，全細(xì)胞催化法在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行催化合成，能夠激活異構(gòu)酶，還可省去繁瑣耗時(shí)的酶純化過(guò)程，并且生產(chǎn)過(guò)程中的反應(yīng)是通過(guò)生命體自動(dòng)調(diào)節(jié)方式進(jìn)行，可充分利用微生物代謝產(chǎn)生的ATP，避免了添加昂貴的ATP，從而使反應(yīng)過(guò)程更高效率、低成本、綠色環(huán)保。

迄今，Neu5Ac的合成工藝已日趨完善，但仍存在一定的改進(jìn)空間。例如，尋找更高活性的合成酶，從而提高全細(xì)胞催化速率；設(shè)計(jì)更高效的合成途徑，構(gòu)建更加穩(wěn)定耐受的工程菌，最大程度上解除反饋抑制與競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)，盡量減少副產(chǎn)物積累，提高工程菌的利用率；尋找更廉價(jià)的底物代替常用底物，降低生產(chǎn)成本；優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行工業(yè)化放大，建立一條簡(jiǎn)便、安全、環(huán)保的生產(chǎn)工藝路線。因此，運(yùn)用代謝工程、基因手段改造及篩選更合適的微生物催化劑仍是重要的研究課題。

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Advances in Production of N-acetyl-D-neuraminic Acid by Whole-cell Biocatalysis

Zhang Congcong Chen Caixia Chen Xiao Wen Ya Yan Liming Tao Yong
（Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101）

N-acetyl-D-neuraminic acid and its derivatives have versatile biological functions and considerable contribution in the therapeutics field. But the production and wide applications of Neu5Ac are limited by the low yield and high cost. With the development of Molecular Biology and the research of Glycomics, the production Neu5Ac by whole-cell biocatalysis, a novel type of biocatalysis, has attracted researchers’ attention. In this paper, we report that the advances in production of Neu5Ac by whole-cell biocatalysis, and also propose some guidelines for future studies.

N-acetyl-D-neuraminic acid；sialic acid；whole-cell biocatalysis；biotransformation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.020

2014-11-17

張叢叢，女，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：andrea718098@163.com

晏禮明，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物工程；E-mail：yanlm@im.ac.cn

陶勇，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：以代謝工程為基礎(chǔ)的新型生物催化劑開(kāi)發(fā)與利用；E-mail：taoyong@im.ac.cn