呂永坤 堵國(guó)成 陳堅(jiān) 周景文

（江南大學(xué)，無(wú)錫 214122）

合成生物學(xué)技術(shù)研究進(jìn)展

呂永坤 堵國(guó)成 陳堅(jiān) 周景文

（江南大學(xué)，無(wú)錫 214122）

合成生物學(xué)是一門(mén)將生物學(xué)工程化的應(yīng)用學(xué)科，目的在于將生命元件標(biāo)準(zhǔn)化和模塊化；也可用于生命起源等基礎(chǔ)理論研究。對(duì)合成生物學(xué)進(jìn)行了較為詳細(xì)地介紹，主要綜述了合成生物學(xué)領(lǐng)域新出現(xiàn)的方法及應(yīng)用。

合成生物學(xué)；生物功能元件；無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)；最小基因組；定向進(jìn)化；基因組編輯

合成生物學(xué)自誕生之日起就受到人們的廣泛關(guān)注。2006年，由美國(guó)國(guó)家科學(xué)院資助的合成生物學(xué)工程研究中心成立；2007年，歐洲委員會(huì)啟動(dòng)了18項(xiàng)合成生物學(xué)領(lǐng)域的主要研究項(xiàng)目；英國(guó)也于2007年將合成生物學(xué)列為高優(yōu)先級(jí)資助研究領(lǐng)域［1］。2008年，時(shí)代周刊將“創(chuàng)造生命”列為十大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一；2009年，英國(guó)皇家工程學(xué)院對(duì)合成生物學(xué)及其應(yīng)用前景和影響進(jìn)行了詳細(xì)介紹。同時(shí)，歐美紛紛向合成生物學(xué)研究領(lǐng)域投入巨資。另一方面，合成生物學(xué)的市場(chǎng)也在迅速擴(kuò)張。BCC Research的研究報(bào)告認(rèn)為，2012年和2013年合成生物學(xué)總的市場(chǎng)份額分別為21億和27億美元；到2018年，該市場(chǎng)份額將達(dá)到118億美元，且2013-2018五年間的復(fù)合年增長(zhǎng)率為34.4%。

合成生物學(xué)起源于工程應(yīng)用，其目的在于簡(jiǎn)化復(fù)雜的自然生物系統(tǒng)，將其變?yōu)楹?jiǎn)單、可靠、質(zhì)量可控的模塊或者零件。這些模塊或零件可以使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（Computer aided design，CAD）來(lái)進(jìn)行精確的預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)，可以進(jìn)行不同的組合以獲得預(yù)期的功能，并且可以在工業(yè)規(guī)模進(jìn)行生產(chǎn)制造［2］。合成生物學(xué)的快速發(fā)展得益于基因合成和測(cè)序等技術(shù)的進(jìn)步。人工合成DNA價(jià)格的持續(xù)下降，使得經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的基因、啟動(dòng)子及其他調(diào)控元件的使用更加廣泛，甚至出現(xiàn)了完全由人工合成的基因組［3］。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展使得測(cè)序的速度空前提高，測(cè)序成本也不斷下降，不斷有新的物種基因組數(shù)據(jù)被公開(kāi)。基因元件功能表征和標(biāo)準(zhǔn)化是設(shè)計(jì)和構(gòu)建具有新特征生物的關(guān)鍵步驟，越來(lái)越多的基因元件被構(gòu)建和測(cè)試。

1 合成生物學(xué)及其起源

目前對(duì)于合成生物學(xué)有多種不同的定義，較普遍的觀點(diǎn)是，合成生物學(xué)的目標(biāo)是設(shè)計(jì)和操縱生物基零件、裝置和系統(tǒng)，創(chuàng)造新功能甚至新物種，也可以對(duì)已有的天然生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)。合成生物學(xué)是一門(mén)應(yīng)用工程學(xué)原理進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)計(jì)的應(yīng)用學(xué)科［9］。要理解合成生物學(xué)首先需要對(duì)其起源進(jìn)行研究。關(guān)于合成生物學(xué)的起源目前有三種不同的看法：高通量化學(xué)合成DNA的實(shí)現(xiàn)；第一個(gè)基因計(jì)時(shí)器［10］和基因電路開(kāi)關(guān)的構(gòu)建［11］；以合成的基因元件構(gòu)建完整的代謝通路。

如果將DNA的高通量化學(xué)合成作為合成生物學(xué)的開(kāi)端，那么合成生物學(xué)其實(shí)是一種新的合成技術(shù)，為代謝途徑的構(gòu)建和調(diào)控提供了一種簡(jiǎn)單廉價(jià)的方法?；瘜W(xué)法合成基因的長(zhǎng)度和類型不斷擴(kuò)展，如今已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)小型基因組的合成［12］。如果以第一個(gè)基因計(jì)時(shí)器或基因電路開(kāi)關(guān)的構(gòu)建作為合成生物學(xué)的開(kāi)端，那么合成生物學(xué)其實(shí)是一種基礎(chǔ)生物學(xué)問(wèn)題研究的新方法。在這種觀點(diǎn)下，細(xì)胞被視為一臺(tái)設(shè)備，化學(xué)合成的DNA賦予其感受環(huán)境變化并以此調(diào)整自身的功能、生理和突變率［13］。這類基因控制元件有許多應(yīng)用，可用以設(shè)計(jì)醫(yī)學(xué)治療的裝置［14］。由于存在巨大的工業(yè)化潛力，合成生物學(xué)在代謝途徑設(shè)計(jì)和構(gòu)建中的應(yīng)用可能是以上三種情況中最受關(guān)注的。然而，從理論的角度來(lái)講，該領(lǐng)域并無(wú)太大貢獻(xiàn)。因?yàn)檠芯空邥?huì)認(rèn)為，大多數(shù)所謂的合成生物學(xué)不過(guò)是在代謝工程中引入化學(xué)合成的DNA而已。

2 生物功能元件

正如電子工程相對(duì)于物理學(xué)一樣，合成生物學(xué)可以理解為生物學(xué)的工程化，而生物功能元件正是該工程領(lǐng)域的基本單元。通過(guò)理性設(shè)計(jì)，將不同功能特征的元件進(jìn)行組合，可以得到具有新功能或新表型的生物體。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)需要依賴于對(duì)生物元件功能的表征、標(biāo)準(zhǔn)化、組裝和調(diào)試，以及對(duì)基因回路、底盤(pán)和整個(gè)體系的設(shè)計(jì)。

2.1 生物功能元件的設(shè)計(jì)、合成和功能表征

生命形態(tài)的多樣性，決定了生命系統(tǒng)可以合成幾乎所有現(xiàn)存有機(jī)化合物；遺傳信息的可編輯性，又提供了創(chuàng)造新的生命形態(tài)的可能性。生物功能元件是合成生物學(xué)的基石，是具有特定功能的最小生物元件，可以是氨基酸序列或核苷酸序列。不同的功能元件可以進(jìn)一步被組合成具有更加復(fù)雜功能的裝置和系統(tǒng)。理論上，通過(guò)對(duì)生物功能元件的設(shè)計(jì)、組合，可以實(shí)現(xiàn)任何有機(jī)化合物和新物種的合成。另一方面，非天然氨基酸的使用、新核酸的開(kāi)發(fā)及隨之而來(lái)的遺傳密碼子表的擴(kuò)展，又可以進(jìn)一步擴(kuò)展化合物和新物種合成的范圍。隨著DNA合成技術(shù)的發(fā)展和商業(yè)化，基因元件合成的保真性和通量不斷提高，同時(shí)成本迅速下降，這為基因元件的大規(guī)模合成提供了基礎(chǔ)。另一方面，高通量篩選技術(shù)的普及，使得人們可以對(duì)大量基因元件進(jìn)行高通量篩選和功能表征。

2.2 生物功能元件的標(biāo)準(zhǔn)化

隨著合成生物學(xué)的誕生，人們即在嘗試將生物功能元件標(biāo)準(zhǔn)化。1996年，Rebatchouk等［15］嘗試通過(guò)克隆技術(shù)建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的基因元件清單，但該研究并未立即引起廣泛的興趣。來(lái)自麻省理工學(xué)院的Kight于2003年提出了“生物磚”（BioBrick）的概念。隨后，大量的研究機(jī)構(gòu)開(kāi)始使用標(biāo)準(zhǔn)的生物磚元件來(lái)構(gòu)建新的生物裝置和生物系統(tǒng)。生物磚是進(jìn)行生物功能元件標(biāo)準(zhǔn)化的重要嘗試，可以將其理解為積木的單元，通過(guò)這些積木不同方式的組合，我們可以組裝出各種不同的結(jié)構(gòu)［16］。通常生物磚元件應(yīng)該包括基因的編碼序列和調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子等。由麻省理工學(xué)院于2003年成立的標(biāo)準(zhǔn)生物元件庫(kù)（Registry of Standard Biological Parts）目前收集了3 400件基因元件，用于組裝生物裝置和生物系統(tǒng)。這些標(biāo)準(zhǔn)的基因元件來(lái)源于學(xué)術(shù)研究機(jī)構(gòu)、科學(xué)家個(gè)人和每年參加國(guó)際遺傳工程機(jī)器設(shè)計(jì)競(jìng)賽（International genetically engineered machine competition，iGEM）的學(xué)生團(tuán)隊(duì)。其中的每個(gè)生物元件都有自己的編碼，還包括其序列、創(chuàng)建者、功能及使用者等信息。這些信息都是公開(kāi)的，可供免費(fèi)使用。

2.3 生物功能元件的組裝

合成生物學(xué)的特點(diǎn)在于，可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化功能元件進(jìn)行組裝，以獲得不同功能的裝置和系統(tǒng)等。但是，由于生命系統(tǒng)的復(fù)雜性及人類認(rèn)知的局限性，合成生物學(xué)往往不能像電氣工程等其它現(xiàn)代工程學(xué)科一樣，將特定功能的基因元件進(jìn)行簡(jiǎn)單的組裝，就可以獲得預(yù)期的結(jié)果［16］。在此過(guò)程中，需要對(duì)元件與元件之間、元件與裝置之間以及裝置與裝置之間進(jìn)行適配和優(yōu)化；同時(shí)，元件、裝置與底盤(pán)之間的兼容性也是重要的影響因素。在此過(guò)程中，高通量的測(cè)試方法和系統(tǒng)生物學(xué)的分析方法等都是進(jìn)行適配和優(yōu)化的有效方法。利用計(jì)算機(jī)輔助的動(dòng)態(tài)模擬，在構(gòu)建之前對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行建模、預(yù)測(cè)和優(yōu)化，這樣可以減少系統(tǒng)測(cè)試的工作量，加快構(gòu)建的速度［9］。如可以對(duì)各種組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合、構(gòu)建接近真實(shí)的生物系統(tǒng)模型、預(yù)測(cè)系統(tǒng)的功能及對(duì)環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)，從而給出優(yōu)化方案。

3 無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)

合成生物學(xué)試圖使用工程學(xué)方法來(lái)縮短設(shè)計(jì)-構(gòu)建-驗(yàn)證的工作周期，因?yàn)槟壳叭斯?gòu)建細(xì)胞的方法工作量極其巨大，且成本較高［17］。另一方面，人們對(duì)復(fù)雜生命活動(dòng)認(rèn)知的局限性，原有部分和合成（外來(lái)）部分之間的干擾，合成途徑的動(dòng)態(tài)監(jiān)控，這些都是目前胞內(nèi)合成生物學(xué)（in vivo synthetic bilogy）所面臨的挑戰(zhàn)［16］，如表1所示［18］。由于不需要為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的輔助環(huán)境，無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)（cell-free synthetic biology）為解決上述問(wèn)題提供了有力的支撐。無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)研究的是，不需要完整活細(xì)胞的條件下進(jìn)行的復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程，這些過(guò)程是在體外進(jìn)行的［19，20］。相對(duì)于胞內(nèi)合成生物學(xué)，無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的特點(diǎn)是，它是一個(gè)開(kāi)放的反應(yīng)體系。相對(duì)于胞內(nèi)合成生物學(xué)，無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)具有許多優(yōu)勢(shì)，如表1所示［21］。

作為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究工具，無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)已被研究了數(shù)十年，然而直到現(xiàn)在無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)用于工業(yè)生產(chǎn)才具有商業(yè)可行性，包括醫(yī)藥、代謝產(chǎn)物和非天然產(chǎn)物［22，23］。無(wú)細(xì)胞體外反應(yīng)體系可以劃分為粗提物無(wú)細(xì)胞反應(yīng)體系（Crude extract cell-free systems，CECFs）和合成酶途徑（Synthetic enzymatic pathways，SEPs）［17］。在選擇反應(yīng)體系時(shí)，首先考慮的因素是需要保留的細(xì)胞“看家”功能（如持續(xù)提供能量）。構(gòu)建SEPs所面臨的主要挑戰(zhàn)是人們對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)功能認(rèn)知的局限性；而CECFs則經(jīng)常發(fā)生不想要的反應(yīng)或者產(chǎn)生某些未知產(chǎn)物。時(shí)間和成本也是需要考慮的因素。例如，在無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，重構(gòu)SEP需要涉及能量代謝、呼吸、轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)折疊等，對(duì)于大多數(shù)商業(yè)應(yīng)用，蛋白質(zhì)的折疊都是價(jià)格高昂的。盡管SEPs和CECFs的應(yīng)用有所重疊（圖1），但依然需要謹(jǐn)慎權(quán)衡二者之間的平衡［17］。以下為無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的主要應(yīng)用。

表1 胞內(nèi)合成生物學(xué)所面臨的挑戰(zhàn)

3.1 蛋白質(zhì)合成

無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成（Cell-free protein synthesis，CFPS）是無(wú)細(xì)胞合成生物技術(shù)最常見(jiàn)的應(yīng)用。CFPS系統(tǒng)可以利用酶轉(zhuǎn)化細(xì)菌、植物或者動(dòng)物細(xì)胞提取物。當(dāng)在系統(tǒng)中提供必要的氨基酸和能量等時(shí)，這些活化的生物催化劑就可以催化氨基酸向多肽的聚合。大腸桿菌CFPS系統(tǒng)高效的蛋白質(zhì)合成能力（＞1 g/L），使得商業(yè)化生產(chǎn)個(gè)性化蛋白質(zhì)藥物［24］、疫苗［25］和難以胞內(nèi)合成的蛋白質(zhì)（如水解酶類）［26］成為可能。

3.2 代謝產(chǎn)物合成

在過(guò)去的研究中，人們開(kāi)始意識(shí)到完整的代謝途徑也能夠在CECF系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)，包括中心代謝、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化等。根據(jù)這一思路，人們正在努力通過(guò)控制CECF生產(chǎn)代謝產(chǎn)物。Panke等［27］設(shè)計(jì)的CECF多酶催化系統(tǒng)，以葡萄糖為底物合成二羥丙酮磷酸（DHAP）。由于DHAP的不穩(wěn)定性，可以直接向反應(yīng)體系中添加丁醛和兔肌肉醛縮酶，將DHAP轉(zhuǎn)化為一種穩(wěn)定形式。相對(duì)于CECFs，SEPs系統(tǒng)多用于小分子的生產(chǎn)［28］。SEPs的優(yōu)勢(shì)在于理性設(shè)計(jì)生物合成網(wǎng)絡(luò)時(shí)的靈活性。Wang等［29］以纖維二糖為底物，通過(guò)一個(gè)12個(gè)酶的SEP系統(tǒng)合成了NADPH形式的氫。其中的纖維素二糖主要由酶解纖維素和稀酸預(yù)處理生物質(zhì)水解物得到。在有酸處理的水解物存在的情況下，大腸桿菌是不能生長(zhǎng)的。這一應(yīng)用實(shí)例顯示了無(wú)細(xì)胞合成技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，即不需要滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。

3.3 基因元件的構(gòu)建

相對(duì)于在體內(nèi)構(gòu)建基因元件，體外方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：反應(yīng)條件的可控性和可預(yù)測(cè)性；大量的已知部件加快原型構(gòu)建的速度；體外基因元件可以轉(zhuǎn)化為真正的基因模塊。得益于體外基因元件構(gòu)建的快速發(fā)展，原型構(gòu)建可以在1個(gè)工作日內(nèi)完成；由4個(gè)基因開(kāi)關(guān)組成的原型則可以在8 h內(nèi)完成［30］。人們開(kāi)發(fā)了諸多無(wú)細(xì)胞元件，包括邏輯門(mén)、存儲(chǔ)單元和振蕩器。其中，邏輯門(mén)包括AND、OR、NOR、XOR、NAND和NOT等；存儲(chǔ)單元有1-輸入雙推和2-輸入開(kāi)關(guān)，以及諸多振蕩器。這些無(wú)細(xì)胞基因元件可以用于組裝最小人工細(xì)胞和細(xì)胞樣微裝置［18］。

3.4 擴(kuò)展生命的化學(xué)結(jié)構(gòu)

非天然氨基酸（Unnatural amino acid，uAA）摻入是無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的又一強(qiáng)大工具，因?yàn)槠湓试S其他的化學(xué)成分摻入到蛋白質(zhì)中，從而可以擴(kuò)展生命的化學(xué)結(jié)構(gòu)。目前有兩種途徑可以實(shí)現(xiàn)uAA的摻入［31，32］。（I）殘基置換法：天然氨基酸類似物能夠被細(xì)胞內(nèi)原有機(jī)制所識(shí)別，從而可以將天然氨基酸置換為相應(yīng)的氨基酸類似物。該方法需要營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主，且僅限于天然氨基酸類似物。（II）密碼子重置或終止密碼子消除法：該方法依賴于突變氨?；?tRNA合成酶/tRNA對(duì)（Mutated aminoacyltRNA synthetase/tRNA，aaRS/tRNA）與uAAs的正交氨?；?，運(yùn)送uAAs至蛋白質(zhì)并被摻入。這兩種方法均在無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)中獲得了成功。將新的化學(xué)物質(zhì)引入蛋白質(zhì)的特定位點(diǎn)具有很多種重要的應(yīng)用，包括將藥物連接到抗體上用于臨床治療［33］，將蛋白質(zhì)按特定方向固定到非生物材料表面［34］，生產(chǎn)功能性病毒樣顆粒［35］，探針和標(biāo)記物摻入［36］等。

另一方面，研究者通過(guò)開(kāi)發(fā)新的核酸來(lái)擴(kuò)展遺傳密碼子表［20］。其中，Benner等通過(guò)重新定位胞嘧啶和鳥(niǎo)嘌呤中氫鍵的供體和受體，獲得了新的堿基對(duì)［異胞嘧啶：異鳥(niǎo)嘌呤（iso-C：iso-G）］。這導(dǎo)致了第65個(gè)密碼子——反密碼子對(duì)的出現(xiàn)，從而可以使uAAs在蛋白質(zhì)體外合成過(guò)程中高效摻入。Benner等［37］對(duì)其工作進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化，創(chuàng)造了人工擴(kuò)展遺傳信息系統(tǒng)（Artificially expanded genetic information system，AEGIS）。通過(guò)重置堿基上氫鍵供體和受體基團(tuán)，將堿基數(shù)量由4個(gè)增加至12個(gè)。其中，堿基Z和P成為研究的焦點(diǎn)，二者不易受到氧化和差向異構(gòu)的影響。在6堿基遺傳密碼子表（G∶C、A∶T、Z∶P）的基礎(chǔ)上，Benner等［38］進(jìn)一步通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了各種各樣的序列，其中包括多個(gè)連續(xù)非天然Z和P的序列。這是令人激動(dòng)的成果，它說(shuō)明這種擁有216種可能密碼子的非天然的遺傳密碼子表（ATGCZP）有可能被用于在體外合成生命［20］。

圖1 無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的分類及應(yīng)用

4 最細(xì)小基因組和最小細(xì)胞

構(gòu)建人工細(xì)胞的關(guān)鍵是獲得最小基因組。最小基因組指的是在最優(yōu)生存條件下，細(xì)胞維持生存所需要的最小的基因集合［39］。最小基因組可以作為特定功能的基因的載體被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞底盤(pán)中，最終構(gòu)建具有特定功能的最小人工細(xì)胞。細(xì)胞底盤(pán)指的是包含代謝系統(tǒng)的容器或分隔的空間，其中不包括遺傳信息或基因組。如果將基因組視為細(xì)胞的軟件系統(tǒng)，則底盤(pán)指的是細(xì)胞的硬件系統(tǒng)。最小細(xì)胞指的是，一定環(huán)境條件下，能夠維持生命活動(dòng)的最小細(xì)胞單元，也可以理解為由最小基因組控制的自主復(fù)制細(xì)胞［39］。最小細(xì)胞不僅具有重要的應(yīng)用價(jià)值，而且可用于研究地球生命的起源。值得注意的是，最小基因組和最小細(xì)胞均為相對(duì)的概念，因物種及其生存環(huán)境不同而異［40］。例如，當(dāng)對(duì)兩個(gè)細(xì)菌的基因組進(jìn)行比較時(shí)，得到的最小基因組由256個(gè)基因組成；當(dāng)對(duì)100個(gè)基因組進(jìn)行比較時(shí)，最小基因組的基因數(shù)減少至63；當(dāng)對(duì)1 000個(gè)基因組進(jìn)行比較時(shí)，最小基因組的基因數(shù)為0［41］。又如，寄生或共生微生物的某些基本生命活動(dòng)（如氨基酸、維生素合成等）相關(guān)的功能基因在進(jìn)化過(guò)程中被簡(jiǎn)化掉了，因?yàn)檫@些微生物可以從寄主中直接獲取這些物質(zhì)；另一方面，與其同源的非寄生微生物則保留有這些功能基因［42］。

最小基因組的研究方法包括比較基因組學(xué)方法、轉(zhuǎn)座子飽和突變法、反義RNA技術(shù)、單基因特異性突變法和基因組簡(jiǎn)化法等［40］。這些方法均存在不足之處，目前無(wú)明確、統(tǒng)一的研究結(jié)果。在最小基因組研究初期，人們期望通過(guò)擴(kuò)大研究的物種范圍，獲得一個(gè)相對(duì)于所有物種通用的最小基因組。然而，這種普適最小基因組可能并不存在［39］。有以下幾方面的原因。（1）在比較基因組學(xué)研究中，當(dāng)物種及其環(huán)境多樣性足夠大時(shí)，人們所獲得的最小基因組的基因數(shù)為0，即并不存在所有物種必需基因的交集［41］。（2）某些生命必需的功能，在不同物種中由非同源的基因所編碼，在同一物種中也可能由多個(gè)基因發(fā)揮同一功能。如短RNA殘留物的降解被認(rèn)為是必需功能，該功能由nanoRNases負(fù)責(zé)。nanoRNases在不同物種中有不同的來(lái)源（orn來(lái)源于Escherichia coli，nrnA和nrnB來(lái)源于Bacillus subtilis，nrnC來(lái)源于Bartonella birtlesii），且orn與nrnA或nrnB在序列上幾乎沒(méi)有相似性［43］；在Bacillus subtilis中則由兩個(gè)不同基因（nrnA、nrnB）所編碼，其中一個(gè)基因的失活不能導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，因此可能被誤認(rèn)為非必需基因；而在E. coli中，nanoRNases只能由orn編碼，因此無(wú)疑是必需的。（3）理論上，通用最小基因組概念的前提是所有生命起源于一個(gè)“最晚出現(xiàn)的共同祖先”（last universal commen ancestor，LUCA）［44］，即所有遺傳信息起源于同一套基因組。然而，LUCA事實(shí)上是一個(gè)初始細(xì)胞的群體，它們的基因組分別是古生菌、真細(xì)菌和真核生物的遺傳基礎(chǔ)?；蚪M的發(fā)展是在細(xì)胞進(jìn)化的后期，在此之前已經(jīng)出現(xiàn)了DNA復(fù)制、脂類合成和RNA降解相關(guān)的酶類的多樣性［45］。（4）以必需基因的集合作為最小基因組，那么最小細(xì)胞只能在最優(yōu)條件下生存，而不能持續(xù)生存，尤其是當(dāng)環(huán)境條件有所波動(dòng)的情況下。

Acevedo-Rocha等［39］分析認(rèn)為，通用最小基因組研究不成功的原因在于以必需基因的集合作為最小基因組；并提出以持續(xù)基因（Persistent gene）的概念來(lái)替代必需基因。持續(xù)基因指的是位于前導(dǎo)鏈上優(yōu)先表達(dá)的基因，在細(xì)胞的長(zhǎng)期繁殖（必需基因的功能）或細(xì)胞的自我維持、修復(fù)中發(fā)揮作用?；蚪M應(yīng)當(dāng)被劃分為兩部分：Paleome和Cenome。Paleome包括持續(xù)基因，與生長(zhǎng)、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、維持和衰老等關(guān)鍵功能有關(guān)。Paleome由大約500個(gè)持續(xù)基因組成，這些基因的功能包括：核心代謝，氨基酸、核苷酸、輔酶、脂類合成，細(xì)胞分裂，氨酰-tRNA合成，轉(zhuǎn)錄和翻譯。Paleome可被進(jìn)一步劃分為持續(xù)必需基因和持續(xù)非必需基因。這些持續(xù)非必需基因被認(rèn)為是可以省卻的，但實(shí)際上其與細(xì)胞的維持與壓力響應(yīng)有關(guān)，消除后將導(dǎo)致細(xì)胞在環(huán)境波動(dòng)時(shí)死亡。Cenome由非持續(xù)基因組成，這些基因負(fù)責(zé)細(xì)胞對(duì)特定環(huán)境的適應(yīng)。因此，Paleome負(fù)責(zé)細(xì)胞在最優(yōu)條件下存活，而Cenome負(fù)責(zé)細(xì)胞在特定自然條件下的長(zhǎng)期生存。Cenome在同一物種的不同個(gè)體之間變換很大。例如，某E. coli的1 500個(gè)非持續(xù)基因（Cenome）與500個(gè)持續(xù)基因（Paleome）組成了該菌株的核心基因組（2 000個(gè)基因），而所有E. coli菌株的Cenome共包括18 000個(gè)基因［46］。

基因持續(xù)的概念在合成人工細(xì)胞時(shí)非常重要，因?yàn)榘凑毡匦杌蚋拍顦?gòu)建的細(xì)胞只能在最優(yōu)的環(huán)境條件下存活；而按照持續(xù)基因概念設(shè)計(jì)的細(xì)胞則可以在特定環(huán)境下長(zhǎng)期生存，并能應(yīng)對(duì)環(huán)境的波動(dòng)。根據(jù)持續(xù)基因概念合成人工細(xì)胞應(yīng)當(dāng)包括如下步驟：（1）對(duì)細(xì)胞需要應(yīng)對(duì)的環(huán)境條件進(jìn)行評(píng)估；（2）根據(jù)環(huán)境條件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，包括去除部分非持續(xù)基因、添加特定功能的基因，得到由paleome、簡(jiǎn)化的cenome和特定功能基因組成的人工基因組；（3）基因的合成與擴(kuò)增；（4）人工基因組在Saccharomyces cerevisiae中組裝；（5）人工基因組轉(zhuǎn)移到合適的底盤(pán)中（圖2）。

圖2 特定環(huán)境下具有特殊功能的最小細(xì)胞的合成策略

5 基因組編輯方法

在許多研究中，人們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒分離、質(zhì)粒上基因表達(dá)的不精確性以及質(zhì)粒保持造成的代謝負(fù)擔(dān)等問(wèn)題隨著質(zhì)?？截悢?shù)的增加而加?。?7］。在基因組上整合表達(dá)顯然可以解決這些問(wèn)題，且避免了抗生素和誘導(dǎo)劑等的使用［48］。由于細(xì)胞系統(tǒng)幾乎所有的功能都由基因組編碼，因此理論上基因組編輯可以重構(gòu)生命系統(tǒng)［49］。在合成生物學(xué)的應(yīng)用中，基因組編輯是異源合成途徑的重構(gòu)及模塊優(yōu)化的基本操作手段。傳統(tǒng)的定點(diǎn)重組酶系統(tǒng)如Cre/lox、PFlp/FRT和φC31等能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因組的編輯，然而這些方法存在諸多不足，如重組效率低，篩選過(guò)程復(fù)雜，存在不利突變的可能性等。近年來(lái)出現(xiàn)的鋅指核酸酶（Zinc-finger nucleases，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)生物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly int-erspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系統(tǒng)使得人們能夠高效、便捷且廉價(jià)地對(duì)基因組進(jìn)行精確編輯。研究者既可以通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)手段在較短的時(shí)間內(nèi)構(gòu)建這些系統(tǒng)，也可以購(gòu)買商業(yè)化的試劑盒或者向生產(chǎn)商購(gòu)買訂制的產(chǎn)品。

5.1 ZFN和TALEN

ZFN是第一個(gè)使用定制DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸內(nèi)切酶。ZFN是異源二聚體，其中每個(gè)亞基含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)FokI核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域。Cys2-His2鋅指結(jié)構(gòu)域是真核生物中最常見(jiàn)的DNA結(jié)合基元。每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域在其保守的ββα構(gòu)型中包含30個(gè)氨基酸，其中α螺旋表面的氨基酸識(shí)別基因組DNA上3-4個(gè)連續(xù)的核苷酸序列。經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)和改造的鋅指結(jié)構(gòu)域已經(jīng)可以識(shí)別所有64個(gè)核苷酸三聯(lián)體；另一方面，鋅指結(jié)構(gòu)域可以由連接肽串聯(lián)，從而可以識(shí)別9-18 nt的DNA序列。經(jīng)過(guò)上述改造，鋅指蛋白理論上可以識(shí)別任意基因組上的任意目標(biāo)序列［50，51］。Fok I為非特異性核酸內(nèi)切酶，但鋅指結(jié)構(gòu)域賦予其切割位點(diǎn)的特異性；Fok I結(jié)構(gòu)域必須二聚化才有活性，確保必須存在兩個(gè)相鄰的DNA結(jié)合事件才能實(shí)現(xiàn)雙鏈斷裂，從而增加了切割特異性。在雙鏈斷裂后，細(xì)胞試圖修復(fù)它。最簡(jiǎn)單的方法是非同源末端接合（Nonhomologous end joining，NHEJ），其中細(xì)胞基本上磨平斷裂DNA的兩端，再將其彼此拉近，這往往產(chǎn)生移碼。另一種方法是同源定向修復(fù)（Homology-directed repair，HDR）。細(xì)胞試圖利用另一條染色體上對(duì)應(yīng)的DNA序列作為模板來(lái)修復(fù)斷裂。也可以通過(guò)提供特定的外源模板，對(duì)斷裂位點(diǎn)進(jìn)行編輯。

TALEN也是二聚的轉(zhuǎn)錄因子/核酸酶，由轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物（Transcription Activator-like Effector，TALE）與FokI內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域融合而成。TALE是植物病原菌Xant-homonas的天然蛋白，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一系列結(jié)構(gòu)重復(fù)而成。每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)包括33-35個(gè)氨基酸，且只能識(shí)別1個(gè)堿基。與鋅指結(jié)構(gòu)域一樣，TALE也通過(guò)重復(fù)結(jié)構(gòu)的串聯(lián)來(lái)識(shí)別特定的DNA序列；且通過(guò)不同的串聯(lián)組合，研究人員可靶定他們想要的任何序列［52］。TALE重復(fù)結(jié)構(gòu)的串聯(lián)可以在數(shù)天內(nèi)快速構(gòu)建［53］。限于三聯(lián)核酸識(shí)別模式，ZFN構(gòu)建困難且成本較高，而TALEN和CRISPR/Cas系統(tǒng)在這方面則具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)。

5.2 CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas是細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來(lái)對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas通過(guò)將入侵噬菌體和質(zhì)粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相應(yīng)的CRISPR RNAs（crRNAs）來(lái)指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性［54］。目前，在基因組定向編輯方面，運(yùn)用最廣泛的是源自于生膿鏈球菌（Streptococcus hyogenes）的Type II CRISPR/Cas9系統(tǒng)。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA（CRISPR-derived RNA）通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA（Trans-activating RNA）結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的基因組序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA，形成雙鏈缺口（Double strand break，DSB）。然后細(xì)菌通過(guò)非同源重組NHEJ或同源重組HDR兩種方式修復(fù)DSB［55］。近來(lái)，研究表明，通過(guò)人工設(shè)計(jì)的sgRNA（Short guide RNA）也可以引導(dǎo)Cas9對(duì)DNA的定點(diǎn)切割（圖3-A）［56］。

研究發(fā)現(xiàn)，Cas9蛋白不具有特異性，只需要一個(gè)特異識(shí)別基因組靶序列的sgRNA，即能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組靶序列核酸酶定向切割。人工合成的sgRNA一般包括3個(gè)部分（圖3-B）：靶序列互補(bǔ)配對(duì)區(qū)（Base-pairing region，20 nt）、Cas9蛋白結(jié)合區(qū)（Cas9 handle Region，42 nt）、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（S. hyogenes terminator，40 nt）。sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別基因組上的PAM（Protospacer adjacent motif）序列（S. hyogenes Cas9識(shí)別序列為NGG），并與PAM序列的5'端20個(gè)核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)，然后Cas9蛋白在PAM序列上游5'端第3個(gè)堿基處切割形成DSB［57］。由于CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因組編輯上的高效、簡(jiǎn)便，這一新技術(shù)目前被廣泛使用，并已成功運(yùn)用于肺炎鏈球菌、大腸桿菌［58］、果蠅［59］、人類、小鼠、斑馬魚(yú)等［60］物種的基因組編輯。

6 定向進(jìn)化

雖然我們已經(jīng)可以從頭合成完整的細(xì)菌基因組及部分真核生物基因組，然而對(duì)于生命系統(tǒng)的認(rèn)知依然有限，這使得我們?cè)诿鎸?duì)一些問(wèn)題時(shí)并無(wú)太多策略。如異源表達(dá)蛋白質(zhì)溶解度低、熱穩(wěn)定性差，合成途徑中多個(gè)基因的協(xié)調(diào)性問(wèn)題，在異源環(huán)境中基因元件功能的優(yōu)化，基因組優(yōu)化以使合成生命獲得預(yù)設(shè)的表型等［61］。定向進(jìn)化并不需要我們預(yù)先了解太多生命系統(tǒng)的相關(guān)信息，從而成為解決這些問(wèn)題的有力工具。本節(jié)主要介紹定向進(jìn)化在合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用及其新發(fā)展。

6.1 定向進(jìn)化在合成生物學(xué)中的應(yīng)用

定向進(jìn)化指的是在實(shí)驗(yàn)室條件下創(chuàng)造突變，并對(duì)突變文庫(kù)施加篩選壓力，從而篩選出具有期望表型的突變體［62］。定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)步驟包括創(chuàng)造隨機(jī)突變，將突變基因在合適的宿主中表達(dá)，以適當(dāng)?shù)暮Y選條件篩選有利突變。重復(fù)上述步驟，經(jīng)過(guò)不斷的循環(huán)有利突變?cè)谳^短的時(shí)間內(nèi)快速積累，并可被用于后續(xù)操作以解決上述問(wèn)題。定向進(jìn)化可以在單分子水平實(shí)施，也可以在合成途徑和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)水平實(shí)施，甚至在細(xì)胞整體水平實(shí)施以直接獲取某些特定表型［61］。

6.1.1 改善酶的催化特性 酶既是生命的基本元素，也可被單獨(dú)用于生物催化，來(lái)合成醫(yī)藥、化學(xué)品和能源。能夠在生產(chǎn)中應(yīng)用的酶應(yīng)當(dāng)具有如下特性，催化活性高、底物特異性強(qiáng)、穩(wěn)定。定向進(jìn)化非常適合于提高酶的上述特性。PhlD被用于藤黃酚的生物催化合成，但PhlD的催化活性和穩(wěn)定性均較差，成為限制其應(yīng)用的重要因素。通過(guò)序列分析，Zha等［63］找到了PhlD的52個(gè)同源基因，并構(gòu)建了容量為1.2×1011的突變體文庫(kù)。使用高通量篩選技術(shù)，篩選到了酶活性和穩(wěn)定性均提高的突變體。來(lái)源于Methanococcus jannaschii的檸蘋(píng)酸合酶（citramalate synthase，CimA）在E. coli中表達(dá)活性較低。檸蘋(píng)酸途徑能夠使L-異亮氨酸缺陷型E. coli在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，且細(xì)胞生長(zhǎng)速率與檸蘋(píng)酸途徑的活性正相關(guān)。根據(jù)這一原理對(duì)CimA在L-異亮氨酸缺陷型E. coli中進(jìn)行定向進(jìn)化。經(jīng)過(guò)6輪定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，得到了1個(gè)活性提高且抗反饋抑制的CimA突變體。突變體使正丙醇和正丁醇的生產(chǎn)效率分別提高了9倍和22倍［64］。

6.1.2 非天然氨基酸摻入 當(dāng)使用密碼子重置法將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)時(shí)，需要3個(gè)元件，即終止密碼子、tRNA和氨酰-tRNA合酶（aaRS）［65］。通過(guò)活性位點(diǎn)的改變，可以改變aaRS攜帶氨基酸的特異性，從而實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的摻入。通過(guò)定向進(jìn)化，已經(jīng)有70多種不同結(jié)構(gòu)的非天然氨基酸摻入到細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)中［32］。雖然非天然氨基酸的摻入可以使蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能發(fā)生變化，但同時(shí)也常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性和穩(wěn)定性的下降。定向進(jìn)化不僅可用于提高天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也可用于提高攜帶有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的活性和穩(wěn)定性［66］。

圖3 Type II CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因組編輯示意圖

6.1.3 基因表達(dá)水平調(diào)控 定向進(jìn)化可以用于基因表達(dá)水平改造，如通過(guò)改造啟動(dòng)子和構(gòu)建操縱子來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。對(duì)組成型啟動(dòng)子PL-λ的衍生物進(jìn)行易錯(cuò)PCR，獲得突變體文庫(kù)。將突變體亞克隆至報(bào)告載體的綠色熒光蛋白GFP基因上游，并轉(zhuǎn)化E.coli。通過(guò)篩選，獲得了22個(gè)不同熒光信號(hào)強(qiáng)度的突變體。以這些突變體來(lái)考察磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響。另外，定向進(jìn)化手段改造啟動(dòng)子也可以用于S. cerevisae。為了同時(shí)調(diào)控多個(gè)相關(guān)基因，而又不分別對(duì)各自的啟動(dòng)子進(jìn)行改造，構(gòu)建操縱子是比較方便的手段之一。為了調(diào)控操縱子內(nèi)多個(gè)基因的表達(dá)水平，需要構(gòu)建和篩選可調(diào)基因間區(qū)（Tunable intergenic region，TIGRs）文庫(kù)［67］。TIGR包括一系列控制元件，包括mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、RNA酶切割位點(diǎn)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）分隔序列（圖4）。以紅色熒光蛋白R(shí)FP和綠色熒光蛋白GFP作為報(bào)告系統(tǒng)，TIGRs可以使兩個(gè)報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度改變100倍。通過(guò)TIGR方法來(lái)平衡甲羥戊酸合成途徑中的3個(gè)基因的表達(dá)水平，可以使甲羥戊酸在E. coli中的產(chǎn)量提高7倍。

圖4 TIGR法調(diào)控操縱子中多基因表達(dá)水平［67］

6.2 定向進(jìn)化的新進(jìn)展

雖然定向進(jìn)化是解決合成生物學(xué)問(wèn)題的有力工具，但是其也受到文庫(kù)大小、篩選效率和進(jìn)化實(shí)驗(yàn)所需時(shí)間等因素的限制。不過(guò)，不斷出現(xiàn)的新方法已經(jīng)可以用于緩解定向進(jìn)化的這些限制，如智能文庫(kù)的構(gòu)建、體內(nèi)定向進(jìn)化等。

6.2.1 智能文庫(kù)構(gòu)建 在突變體文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，傳統(tǒng)的定向進(jìn)化使用的是隨機(jī)突變的策略。在隨機(jī)突變產(chǎn)生的大量突變體中，有利突變往往并不占多數(shù)，但文庫(kù)容量的增加又增加了篩選的難度。而智能文庫(kù)指的就是容量較小且富含有益突變的突變體文庫(kù)。重構(gòu)的進(jìn)化適應(yīng)途徑（Reconstructed evolutionary adaptive path，REAP）分析是構(gòu)建智能文庫(kù)的方法之一［68］。REAP被用于擴(kuò)展DNA聚合酶的底物譜。通過(guò)分析一系列DNA聚合酶在進(jìn)化過(guò)程中的保守位點(diǎn)和可變位點(diǎn)，找到進(jìn)行基因突變的位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)93個(gè)突變體的篩選，得到兩個(gè)能夠高效利用新底物的突變體。相對(duì)于傳統(tǒng)的隨機(jī)突變文庫(kù)，從智能文庫(kù)中篩選出有利突變的效率極大地提高。當(dāng)需要進(jìn)化的對(duì)象的遺傳信息未知時(shí)，可以使用另一種被稱為截短的宏基因組基因特異性PCR的方法［69］。該方法將環(huán)境中的DNA按照功能進(jìn)行篩選，接著使用一套引物擴(kuò)增其中具有一定同源性的基因，從而得到一個(gè)具有功能和遺傳特異性的突變體文庫(kù)。

6.2.2 體內(nèi)定向進(jìn)化 體內(nèi)定向進(jìn)化策略可以簡(jiǎn)化定向進(jìn)化的實(shí)驗(yàn)操作，并減少人為因素的干擾。噬菌體輔助持續(xù)進(jìn)化（Phage-assisted continuous evolution，PACE）就是很好的例子［70］。在PACE實(shí)驗(yàn)中，E. coli持續(xù)流經(jīng)一個(gè)裝有復(fù)制性噬菌體的裝置，復(fù)制性噬菌體攜帶有目的基因。噬菌體要產(chǎn)生具有侵染力的后代需要pIII蛋白質(zhì)，而研究者將噬菌體合成pIII蛋白質(zhì)的能力與目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能相偶聯(lián)。因此，當(dāng)噬菌體感染流經(jīng)的E. coli，并編碼具有功能的目標(biāo)蛋白質(zhì)時(shí)，可以產(chǎn)生pIII，進(jìn)而產(chǎn)生具有侵染能力的后代噬菌體；當(dāng)噬菌體編碼的蛋白質(zhì)不具有功能時(shí)，pIII不能被合成，進(jìn)而不能產(chǎn)生具有侵染能力的后代噬菌體。期間，噬菌體持續(xù)受到突變，并產(chǎn)生新的突變體。具有侵染能力的后代噬菌體不斷繁殖，而無(wú)侵染能力的后代噬菌體被洗出。最終，有利突變隨著具有侵染能力的噬菌體的富集而得到富集（圖5）。

基于邊突變邊進(jìn)化的原則，李寅等提出了基于基因組復(fù)制工程的連續(xù)進(jìn)化（Genome replication Engineering assisted continuous evolution，GREACE）的概念［71］。GREACE的原理是通過(guò)在微生物細(xì)胞中引入一系列經(jīng)遺傳修飾的DNA聚合酶校正元件，使細(xì)胞進(jìn)入一種高突變率的狀態(tài)，從而在篩選壓力條件下加速進(jìn)化過(guò)程。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的進(jìn)化后，將遺傳改造的校正元件從細(xì)胞中移除，這時(shí)細(xì)胞就能維持其基因型的穩(wěn)定，同時(shí)能將這種優(yōu)勢(shì)表型遺傳下去。

圖5 PACE原理示意圖

7 合成生物學(xué)的應(yīng)用

最初合成生物學(xué)發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力來(lái)源于對(duì)可再生性生物燃料的追求，人們期望通過(guò)合成自然界中不存在的生物，來(lái)將大量存在的糖類和纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化燃料。現(xiàn)如今合成生物學(xué)的應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展至很多領(lǐng)域領(lǐng)域，如生物燃料生產(chǎn)、天然產(chǎn)物合成、生物醫(yī)藥、合成新物種等。

7.1 生物燃料

石化資源的不斷枯竭及其燃燒產(chǎn)生的污染迫使人們尋求新的可替代清潔能源，通過(guò)微生物大規(guī)模生產(chǎn)生物燃料就是其中之一。如生物乙醇已經(jīng)在部分國(guó)家實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，而丁醇、異丁醇、生物柴油等物理化學(xué)性狀更優(yōu)的生物燃料的應(yīng)用也在探索中［72，73］。合成生物學(xué)使得人們可以將生物燃料的合成代謝途徑異位重構(gòu)至性狀優(yōu)良的微生物中，如Escherichia coli、Lactobacillus、Pseudomonas putida和Bacillus subtilis等。相對(duì)于傳統(tǒng)的生產(chǎn)菌，這些工程菌具有很多優(yōu)勢(shì)，如生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、易于遺傳改造和代謝副產(chǎn)物少等［74］。不過(guò)，生物燃料對(duì)微生物自身普遍具有毒害作用［75］，這也是人工合成微生物在高效生產(chǎn)生物燃料的過(guò)程中所面臨的最大挑戰(zhàn)。突變和遺傳改造等策略已經(jīng)被應(yīng)用于構(gòu)建生物燃料耐受性菌株［76，77］，且生產(chǎn)過(guò)程表明其耐受性明顯提高。但是，人工合成微生物的生物燃料耐受性機(jī)制并不十分清楚，這成為阻礙理性設(shè)計(jì)耐受性更強(qiáng)微生物的最大障礙［74］。Kim等［78］和Lee等［79］針對(duì)這一基礎(chǔ)問(wèn)題展開(kāi)了研究，以期為提高生物燃料耐受性提供更加理性的策略。

7.2 天然產(chǎn)物

來(lái)源于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的性質(zhì)與化學(xué)法合成的化合物差異很大。天然產(chǎn)物有著長(zhǎng)期作為藥物使用的歷史，但是它們往往難以得到單一的化合物，且來(lái)源有限。與高通量測(cè)序技術(shù)及質(zhì)譜分析技術(shù)等相結(jié)合，合成生物學(xué)將外源的代謝途徑引入易于遺傳改造的模式微生物中，實(shí)現(xiàn)了天然產(chǎn)物的高效生產(chǎn)。其中，代表性的天然產(chǎn)物包括青蒿素、黃酮類化合物等。Keasling及其團(tuán)隊(duì)將青蒿中的紫穗槐-4，11-二烯合酶基因（ADS）導(dǎo)入大腸桿菌中表達(dá)，同時(shí)用酵母萜類合成途徑代替大腸桿菌萜類合成途徑，首次在微生物體內(nèi)合成出青蒿素的第一個(gè)關(guān)鍵前體——紫穗槐-4，11-二烯［80］。而后他們又將ADS基因連同細(xì)胞色素P450單氧化酶基因（CYP71AV1）及其還原酶基因（CPR）同時(shí)導(dǎo)入釀酒酵母中表達(dá)，培育出世界上第一株生產(chǎn)青蒿酸的酵母工程菌［81］。國(guó)內(nèi)江南大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)人工合成、密碼子優(yōu)化及異源表達(dá)黃酮類化合物合成相關(guān)基因，實(shí)現(xiàn)了多種黃酮類化合物在大腸桿菌中的合成；通過(guò)模塊化策略，使圣草酚的產(chǎn)量達(dá)到107 mg/L［82］。

7.3 醫(yī)藥領(lǐng)域

合成生物學(xué)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用主要有體內(nèi)文庫(kù)構(gòu)建、藥物發(fā)現(xiàn)、藥物合成、藥物輸送和藥物優(yōu)化等方面［83］。（1）體內(nèi)文庫(kù)構(gòu)建：將待篩選的化合物在細(xì)胞中表達(dá)，該文庫(kù)可以隨著細(xì)胞的培養(yǎng)而得到保存和擴(kuò)增。（2）藥物發(fā)現(xiàn)：為了充分發(fā)揮體內(nèi)文庫(kù)的優(yōu)勢(shì)，可以利用顏色信號(hào)或者可篩選的遺傳表型等胞內(nèi)分析方法來(lái)檢測(cè)和篩選陽(yáng)性克隆。不斷增加的生物傳感器可以作為檢測(cè)工具。（3）藥物合成：通過(guò)合成代謝途徑的異位重構(gòu)，一些重要的天然產(chǎn)物已經(jīng)被成功合成，如萜類、聚酮化合物、非核糖體多肽、生物堿等。合成生物學(xué)還可以對(duì)這些合成途徑進(jìn)行精確調(diào)控。（4）藥物輸送：通過(guò)合成生物學(xué)方法，可以理性設(shè)計(jì)微生物使其能夠作為藥物輸送的載體，且具有安全性。通過(guò)活體接種，這些攜帶藥物（如益生菌、抗腫瘤藥物等）的微生物侵襲特定的靶點(diǎn)（如腫瘤）［84］，在釋放前藥之后自毀。（5）藥物優(yōu)化：蛋白質(zhì)等藥物的修飾可以使其具有更好藥效和更長(zhǎng)半衰期，通過(guò)在大腸桿菌中構(gòu)建翻譯后修飾系統(tǒng)，使得大腸桿菌能夠生產(chǎn)經(jīng)過(guò)特定修飾的重組藥物蛋白［85］。

7.4 新物種合成

2010年，Gibson等［3］將一個(gè)1.08 Mb的Mycoplasma mycoides人工合成染色體轉(zhuǎn)移到M. capricolum受體細(xì)胞中，創(chuàng)造出一個(gè)全新的M. mycoides細(xì)胞。該細(xì)胞完全由人工合成的基因組控制，并具有預(yù)期的表型特征，且能夠自主復(fù)制。這被認(rèn)為是第一個(gè)人工合成細(xì)胞。不過(guò)，該細(xì)胞只能在最理想的環(huán)境條件下存活和自主復(fù)制，而不是在真正的自然環(huán)境中。關(guān)于真正的生命形式有不同的定義，因此，對(duì)于合成生命也就有不同的看法。一般的觀點(diǎn)認(rèn)為，單細(xì)胞生命不僅僅包括其自身的生化和生理特性，還應(yīng)當(dāng)包括其所生存的環(huán)境條件，如主要的物質(zhì)來(lái)源和能量來(lái)源、滲透壓、離子強(qiáng)度等［86］。自下而上的細(xì)胞合成一般需要滿足三方面的特征：遺傳信息、代謝和自組織。這三個(gè)特征對(duì)于具有自主復(fù)制和進(jìn)化功能的合成生命是必不可少的［87］。雖然目前尚不能合成同時(shí)具有上述三個(gè)特征的生命形式，但合成生物學(xué)已經(jīng)分別在這三方面取得了一定的進(jìn)展［86］。

8 展望

雖然合成生物學(xué)研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，且有著很好的應(yīng)用前景，但依然面臨諸多挑戰(zhàn)。2010年，Roberta Kwok在Nature雜志上撰文認(rèn)為，合成生物學(xué)需要面對(duì)五大難題［9，16］：（1）大部分生物元件的特征尚不明確，我們不清楚它們?cè)诓煌妆P(pán)或者不同實(shí)驗(yàn)條件下的表型特征，甚至不知道它們能用來(lái)干什么；（2）功能回路的不可預(yù)期，即我們不能像其他現(xiàn)代工程技術(shù)一樣，將基因零件簡(jiǎn)單的組裝起來(lái)就能獲得預(yù)期的功能；（3）系統(tǒng)過(guò)于復(fù)雜，即隨著系統(tǒng)的不斷擴(kuò)大，構(gòu)建和測(cè)試變得非常困難；（4）不兼容性，即外源的基因元件和底盤(pán)之間往往不兼容；（5）變異對(duì)于系統(tǒng)的影響，胞內(nèi)分子具有波動(dòng)性或噪音，這將影響細(xì)胞的功能，而這些隨機(jī)變異的積累將最終摧毀回路。生命是復(fù)雜而精密的系統(tǒng)，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯后修飾到代謝網(wǎng)絡(luò)之間的協(xié)調(diào)，以及細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與外界環(huán)境之間的互動(dòng)，這些都需要在特定的時(shí)間和空間上發(fā)生。對(duì)于生命認(rèn)知的局限性是限制人們理性設(shè)計(jì)、構(gòu)建和測(cè)試合成生命的最大障礙。人們對(duì)于不同元件、裝置和系統(tǒng)的構(gòu)建和測(cè)試，使得生物合成相關(guān)的數(shù)據(jù)迅速擴(kuò)增。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)的整合，形成對(duì)生命系統(tǒng)較為完整的認(rèn)知，是需要解決的問(wèn)題和合成生物學(xué)的發(fā)展方向［1］。

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Advances in Synthetic Biology

Lü Yongkun Du Guocheng Chen Jian Zhou Jingwen
（Jiangnan University，Wuxi 214122）

Synthetic biology is an applied discipline that introduces engineering into biology. The aim of synthetic biology is to standardize and modularize biological parts. It can also be applied in the basic researches，such as the research of life origin. This review gives a detailed introduction to the synthetic biology，especially the new methods and applications.

synthetic biology；biological part；cell-free synthetic biology；minimal genome；directed evolution；genome editing

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.017

2015-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370130），江南大學(xué)自主科研計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（JUSRP51307A）

呂永坤，男，博士研究生，研究方向：合成生物學(xué)；E-mail：lykun2012@sina.com

周景文，男，博士，教授，研究方向：合成生物學(xué)、代謝工程；E-mail：zhoujw1982@jiangnan.edu.cn