俞洋李江張釗樊春海

（1.上?？萍脊芾砀刹繉W院電子信息系，上海 201800；2.中國科學院上海應用物理研究所，上海 201800；3. 丹麥奧胡斯大學化學系，奧胡斯 8000）

基于DNA自組裝過程的納米結構研究

俞洋1李江2張釗3樊春海2

（1.上?？萍脊芾砀刹繉W院電子信息系，上海 201800；2.中國科學院上海應用物理研究所，上海 201800；3. 丹麥奧胡斯大學化學系，奧胡斯 8000）

基于DNA自組裝的納米結構在近年來取得了巨大的發(fā)展?；仡櫫薉NA納米結構的原理和發(fā)展歷程，介紹了DNA納米結構的特點和優(yōu)勢，對DNA納米結構在生物檢測、納米反應器、可控排布、納米機器人和藥物遞送領域的新進展和應用進行了綜述，并對DNA納米技術的未來進行了展望。

DNA折紙；納米機器；納米藥物

DNA作為遺傳物質是生命體得以延續(xù)與傳承的重要組成部分，有趣的是，隨著納米技術的發(fā)展，研究者也逐漸認識到DNA也是一種典型的納米材料。它的雙螺旋直徑約為2 nm，螺距為3.4-3.6 nm，而每個堿基的長度約為0.34 nm［1］。雙鏈DNA是一個剛性的高分子材料，其回轉長度達50 nm；而單鏈DNA則具有較大的靈活性。特別是DNA具有出色的可編碼性，可以根據(jù)堿基配對原則進行比較精確的設計。這些特征使我們可以構造出變化多樣的納米結構［2］。紐約大學的Nadrian Seeman教授在20世紀80-90年代就提出可以用DNA分子組裝出納米圖形，并引領了整個DNA納米技術領域的發(fā)展［3］。

DNA納米技術在近20年來得到了迅猛的發(fā)展［4，5］。構造自組裝DNA納米結構有兩種主要方法，包括Seeman課題組發(fā)展的瓦塊（tile）自組裝［6，7］和Paul Rothemund博士發(fā)明的DNA折紙術（DNA origami）［8］。本文將主要回顧DNA自組裝納米結構的設計、制造及應用。

1 DNA自組裝納米技術簡介

構造自組裝DNA納米結構主要有兩大類方法。1998年，Seeman課題組發(fā)展了瓦塊（tile）自組裝，使我們可以在原子力顯微鏡（Atomic force microscope，AFM）下看到了DNA構造的二維網(wǎng)格結構［6，7］。經(jīng)過多年發(fā)展，利用瓦塊自組裝可以構造出豐富多彩的納米結構，包括一維線性排列［9］、二維平面網(wǎng)格、可尋址陣列、納米纖維、三維多面體乃至三維晶體［10］等。但是，這種類型的結構也存在一些不足。例如，它們的組裝依賴多條DNA鏈間的精確互補配對，對各鏈的化學計量比和熱力學性質要求較嚴格，組裝過程相對繁瑣費時；而且，由于受到瓦塊單元的限制，它們的最終結構的復雜程度也是很有限的。

2006年，加州理工學院的Paul Rothemund博士發(fā)明了DNA折紙術（DNA origami），這一里程碑式的技術使制作復雜DNA自組裝結構的能力得到極大提升［8］。DNA折紙術本質上是一種成核自組裝（Nucleation assembly），這不同于瓦塊自組裝的層次自組裝（Hierarchical assembly）。其整個組裝過程是圍繞若干成核點（或稱成核鏈）一次進行而不分步的。DNA成核自組裝的思想由來已久，然而當Rothemund基于這一思想，提出、設計、并實現(xiàn)了DNA折紙術［8］，研究者馬上發(fā)現(xiàn)DNA折紙術生成圖形的復雜度較瓦塊自組裝至少提高了一個數(shù)量級，而且其編碼便捷、實驗簡單、反應快速，因而受到了極大的關注。所謂“DNA折紙術”，就是把一根長的DNA單鏈像折一張紙一樣，綁定并鋪展成某個特定形狀。事實上，“折紙”并非很恰切的比喻，這種技術更為類似織毛衣的過程（圖1-A）。Rothemund使用的這根“毛線”（即成核長鏈）是M13mp18噬菌體的單鏈DNA，有7 249個堿基。Rothemund將這條成核鏈稱為骨架鏈（Scaffold），而用來綁定骨架鏈的互補短鏈則稱為訂書釘鏈（Staple）。Rothemund設計的訂書釘鏈大多數(shù)為32個堿基，以8個堿基為一個單元。整個骨架鏈為200多條訂書釘鏈完全互補為雙鏈，從而凝固成剛性的結構。DNA折紙術產生的圖形復雜度遠遠超過了以前的絕大多數(shù)DNA自組裝結構。其像素點數(shù)目較之前的瓦塊自組裝至少高10倍；單個折紙術圖形分子量為4.7 MDa，超越了自然界最復雜的自組裝機器——真核生物核糖體（4.2 MDa）；而且折紙術可以一次產生500億個拷貝的圖形。

Rothemund在這篇里程碑論文中展示的圖形均為對稱結構（圖1-B）。隨后，上海交通大學和中國科學院上海應用物理研究所的研究人員用DNA折紙術構造了第一個非對稱結構，即中國地圖模擬圖［11］（圖1-C），丹麥奧胡斯大學則設計出了尾部可以活動的海豚形狀（奧胡斯大學的?；眨瑘D1-D）［12］。2009年，多個課題組接連報道了三維DNA折紙術方面進展。Andersen等折出了一個六面體的空心盒子，而且其中一個面還能通過鏈置換反應人為控制開閉（圖1-E）［13］；Ke等［14］也用DNA折紙術得到了一個立體結構——空心四面體（圖1-F）。Kuzuya等［15］根據(jù)前者得到了一個空心立方體，而且通過選擇性加入跨面訂書釘鏈，可以控制立方體的整體構型。哈佛大學的William Shih小組在提出了“蜂窩褶狀模型”（Honeycomb-pleated），構造了諸多三維圖形，包括塊狀巨石（多面體）、方形螺帽（有孔三維）、橋式結構（細線連接）、細頸瓶（同向嵌套結構）、插槽交叉（垂直向嵌套結構）、堆積交叉（垂直向堆積結構）等（圖1-G）［16］。他們通過控制交叉處的間距，進一步制造出整體扭曲或彎折的三維圖形［17］。顏灝的研究組［18］更是展示了精美的曲面三維納米花瓶結構（圖1-H）。

2012年，哈佛大學的殷鵬與Shih教授的研究組發(fā)表了一種類似于瓦塊組裝技術的DNA“積木”組裝技術［19］。這種技術以DNA單鏈為“積木”，每個積木上不同區(qū)域的序列可以與另外的“積木”上的對應序列互補雜交。并且，由于DNA螺旋轉角的確定性，這樣的單鏈積木在組裝之后的構型也是確定的。這樣，在經(jīng)過精心的序列設計之后，研究者們可以像組裝樂高積木一樣將這些DNA單鏈組裝為各種三維幾何體，包括三維的英文字母等有著復雜表面的立體結構，展現(xiàn)了這一技術在幾何構型上的幾乎無限的可能。這一方法不再需要多鏈組裝的結構單元，每一條DNA單鏈即是一個結構單元，最終結構可由一步退火完成；同時，這種結構也是一種“去中心化”的結構，不再受到DNA折紙術中骨架鏈的長度和序列限制，在結構設計上更為自由。

2 DNA納米技術的應用

DNA納米技術不僅可以產生漂亮的圖形，而且還在很多領域具有重要應用價值。例如，Shih課題組［20］將DNA折紙術形成的納米管作為介質，可以在用核磁共振（NMR）測定膜蛋白結構中產生積極作用。Steinhauer等［21］基于熒光標記的DNA折紙圖形發(fā)展出用于校準超分辨率顯微鏡的工具尺。Rothemund與IBM公司合作將DNA折紙術與光刻技術結合起來，可以將折紙圖形定向固定在宏觀基底上，實現(xiàn)了在宏觀上對電子器件的納米級精確排布［22，23］。DNA折紙術最大的優(yōu)點是所有位點都可以在其產生的結構上直接尋址，因而可以作為納米尺度可控排布的理想模板。以下將重點介紹基于這種可控排布的若干應用。

圖1 DNA折紙術的研究進展

2.1 生物分子檢測

生物分子的檢測對于疾病早期診斷、食品安全乃至反恐方面都有著重要的意義。然而，常規(guī)方法難以實現(xiàn)在納米尺度的生物檢測。DNA折紙術則提供了一種可以在納米尺度操控生物分子識別的新方法。2008年，Ke等［24］開發(fā)了DNA折紙芯片，通過V字形探針的設計方式，能夠在AFM下直接檢測到核酸雜交結果，從而實現(xiàn)對小RNA的靈敏檢測（圖2-A）［25］。Zhang等［26］以DNA中國地圖模擬圖為基底，制備了新型的無標記折紙芯片。這種芯片由于本身是非對稱圖形，所以無需添加“索引”。

核酸適配體（Aptamer）是一類利用指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術，從隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得的能夠與靶分子特異結合的短單鏈寡核苷酸配體。由于aptamer本身也是核酸構成的，所以在DNA自組裝結構中應用非常方便。顏灝課題組用核酸適配體實現(xiàn)了多種蛋白在同一個DNA折紙模板上特異性可編碼排布［27］。Rinker等［28］則通過控制核酸適配體的間距離，實現(xiàn)了高親和力的多價結合（Multivalent binding）。Lin等［29］把DNA基底上的核酸適配體用于檢測，可以通過熒光信號檢測溶液中的特異蛋白。之后他們通過競爭機制造成DNA結構熒光顏色的變化，并用調色的辦法來形成多種顏色作為條形碼，從而一次檢驗多種蛋白［30］。他們還嘗試用雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction，HCR）對信號進行放大，成功使檢測靈敏度提高了兩個數(shù)量級［31］。2009年，樊春海研究組［32］構建了載帶有針對不同靶標分子的核酸適配體的DNA四面體“邏輯門”探針（圖2-B），當檢測樣本中出現(xiàn)一種或多種靶標分子時，四面體的構象會因為核酸適配體的構型變化而發(fā)生相應變化，從而產生不同的熒光共振能量轉移（Fluorescent resonance energr transfer，F(xiàn)RET）效應，實現(xiàn)相當于與門、或門、與非門等邏輯門的邏輯判定。并且，該邏輯門檢測策略還可用于對細胞內的靶標分子的檢測。

2.2 DNA納米機器人

發(fā)展可以在納米尺度運動的機器人是納米技術的目標之一。DNA折紙術同樣提供了一個強大的平臺用于納米機器人的研究。自20世紀90年代以來，已有多種動態(tài)DNA納米機器被相繼報道［33，34］。它們還可采用金屬離子［35］、質子［36，37］、DNA鏈或酶反應［38-40］驅動。例如，Gu等［41］把兩種DNA納米結構元件插入帶兩個卡槽的DNA折紙圖形中，于是兩個元件就有4種可能的狀態(tài)組合。他們設計出在每種組合下兩個器件都能共同捕獲一個特異的識別分子，從而用AFM確認了這個動態(tài)系統(tǒng)的正常工作（圖2-C）。之后，Gu等［42］在一個階梯狀折紙基底上依次放3個卡槽，并設計了一個三臂四足的機器人。機器人在基底上運動，行進過程中通過判斷3個卡槽的狀態(tài)來決定是否接納對應的貨物。他們用3種納米金粒子作為貨物，并在透視電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM）下觀察納米金的排布形狀，結果顯示能特異的得到8種貨物組合的任意一種（圖2-D）。這樣就形成了一個迷你的納米組裝生產線。DNA納米機器人中的另一個經(jīng)典工作是一種在折紙圖形表面行走的分子蜘蛛［43］。該“蜘蛛”的模型是由Pei等［44］開發(fā)出來，它的“身子”是一個四價鏈霉親和素，三只腳的序列包含一段核酶，核酶對雜交基底的切割是“蜘蛛”行進的關鍵。研究者在折紙術上構造了一系列連續(xù)的路徑，然后用AFM來捕捉“蜘蛛”的移動，這可以說是一個真正意義上的分子機器人［45］。

2.3 DNA納米反應器

化學反應的速率在很大程度上取決于溶液中分子的碰撞幾率。因此，如果能夠將兩個分子或基團的空間位置拉近，形成一種反應中心或活性域，那么就可以極大提高化學反應的效率。用DNA納米結構作為模板來組織引導化學反應（DNA-directed/ templated reaction），從而構建納米生物反應器，是一個新興的研究方向［46-48］。

丹麥奧胡斯大學CDNA中心的Gothelf組開發(fā)了一種稱為線型DNA模塊（linear/tripoidal oligonucleotide functionalized modules，LOM） 或 三 岔 型NDA模 塊（tripoidal olgonucleotide functinalized module，TOM）。LOM的核心是一段3苯環(huán)串聯(lián)［49］（也可以5苯環(huán)［50］）的有機結構，兩端兩個苯環(huán)上面各有一個半salen的結構域，此外還各連有一條DNA單鏈。如果把每個LOM看做一個構件，那么構件間就通過兩側的DNA鏈互補連接，形成一維線性產物。由于設計的互補鏈修飾位置是相反的，所以在該產物中，兩個半salen結構域恰好“頂在一起”，此時當加入錳鹽和乙二胺，將發(fā)生metal-salen反應，使得瓦塊間不僅依靠DNA雜交相連，而且苯環(huán)部分也“粘”在了一起。研究發(fā)現(xiàn)，此時即使把DNA鏈切斷（通過引入二硫鍵），線性結構依然牢固［51］。這樣，整個過程就相當于借助DNA的配對來誘使其他有機結構的聚合，而且由于苯環(huán)骨架和metalsalen配合物都是共面的，這為將來制造納米線路提供了新的思路［52］。TOM與LOM原理相同，只不過TOM是個三臂結構，能夠形成更復雜的二維組裝產物［53］。另外，核心的metal-salen反應也可以替換為酸性環(huán)境的還原胺化反應（Reductive amination，產物為Tetrahydrosalen），產物甚至更穩(wěn)定［54］。除了LOM/TOM模塊，該小組最近還用DNA雙鏈［55］或4螺旋束tile（4HB）［56］來控制有機棒（Organic rods）的耦合，其距離已精確到雙螺旋內的兩條單鏈。

以色列希伯來大學的Willner課題組在金電極上伸出單鏈DNA作為模板，然后在中間和末端的兩個位置分別結合連有不同反應基團的兩條DNA。不同的基團排列順序、不同的基團與電極間距離，導致了電流強度的改變，據(jù)此檢測和驗證結果。參與的反應包括葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）-二茂鐵、GOx-MP11（微過氧化物酶-11）等生物電催化反應［57］，CdS納米顆粒-relay（類似“繼電器”作用的分子）、光敏劑（Ru2+）-relay等光電化學反應［58］，熒光基團與QD的FRET反應［59］等。有的還通過加入酶等實現(xiàn)了可逆反應［59］。他們的另一個工作是用DNA自組裝得到特定的結構，然后在相鄰孔洞內修飾不同輔酶（實際使用兩套輔酶對，分別是GOx-HRP和GDH-NAD+）。由于輔酶對離得很近，所以能夠形成級聯(lián)反應，反應效率比沒有DNA模板時高出很多，說明DNA網(wǎng)格確實起著拉近距離的作用（圖2-E）［60］。他們又把這套體系移植到DNA納米線上，納米線是先由4條DNA組成圓形結構，然后借助可卡因分子組裝而成。相鄰tile上分別修飾GOx和HRP，其反應效率比沒有DNA模板或可卡因時高6倍以上［61］。

在Gothelf與樊春海研究小組的合作研究中［62］，他們則用DNA折紙結構作為模板固定GOx與HRP。這一結構不但能精確控制兩種酶分子之間的距離，還能在展開的二維平面與卷曲的三維管狀結構之間變換（圖2-F）。研究結果表明，這樣的結構變化能明顯影響到雙酶系統(tǒng)反應的效率。當酶分子被卷入DNA納米管結構內部后，反應效率明顯增強。研究者們認為這是對自然界細胞內部受限空間內發(fā)生的生化反應的一種模擬，在這樣的限域空間內，酶分子與反應各組分的局域濃度較高，因此，盡管其在宏觀尺度上的平均濃度很低，但也能獲得較高的反應效率。根據(jù)這樣的機制和策略，人們可以更好地效法自然界設計和構建高效的納米生物反應器。

2.4 無機納米材料可控排布

DNA納米結構具有精確可控的優(yōu)勢，然而DNA本身缺乏明顯的光電效應，因而難以在光學或電子學領域發(fā)揮作用。幸運的是，DNA納米結構可以引導具有光電效應的無機納米粒子的精確排布，從而制備出具有可控光電性質的納米結構。

2.4.1 納米金粒子 納米金粒子（Au nanoparticle）在水中形成的分散系俗稱膠體金，金顆?？膳c氨基發(fā)生非共價的靜電吸附而牢固結合，與巰基之間形成很強的Au-S鍵，后者也是最常用的納米金與DNA的結合方式。2004年，Seeman小組率先用雜交法實現(xiàn)了納米金的條紋排列［63］，之后他們又完成了兩種大小納米金的有序交叉排列［64］。利用類似的方法，Hung等［23］和Gerdon等［65］想在“已特異吸附在固相表面的折紙圖形”上進一步修飾納米金時，Ding等［66］和Pal等［67］在DNA折紙三角形上線性排列納米金。Sharma等［68］則把硫醇修飾的DNA改為用酯化的硫辛酸修飾，從而與金的結合由一個硫鍵變?yōu)榱藘蓚€硫鍵，進而顯著提高了這種方法的產率。他們在折紙術矩形的兩個位置特異的連接了兩個金球，效率高達90%以上。

除了可以在DNA模板上排布金球，還能實現(xiàn)在DNA上生長金球。Stearns等利用無機結合肽（Inorganic binding peptides，IBPs）對金離子的成核作用，先用雜交法把IBP連接到納米管上，再加入AuCl4使成核，最終也得到了納米金顆粒的一維排布［69］。納米金不但能被DNA排布，有時候它還會反作用于自組裝圖形。2009年，Sharma等［70］在DX lattice中修飾納米金，由于所使用的金球直徑大于DNA結構上金球連接位點的平面距離，于是金球的斥力使得平面array卷曲成納米管狀，且通過控制金球大小可以控制得到的納米管構型（圖2-G）。

圖2 DNA納米結構的代表性應用

2.4.2 碳納米管 碳納米管（Carbon nanotubes）是由一層或多層石墨按照一定方式卷曲而成的具有管狀結構的納米材料。自從1991年日本科學家Sumio Iijima發(fā)現(xiàn)碳納米管以來［71］，碳納米管以其優(yōu)異的熱學、力學以及光電特性［72］受到了多個領域研究者的廣泛關注［73，74］，并實現(xiàn)了多種應用［75，76］。對于特定的碳納米管，控制其屬性甚至功能化的關鍵，在于對其進行特定的組裝與排布。用DNA來識別、篩選、組裝、排列碳納米管，需要解決把DNA與CNT連接起來的問題。2002年，Dwyer等［77］發(fā)明了在DNA末端修飾氨基，再與碳納米管末端連接的方法［78］。他還據(jù)此提出了用DNA排布碳納米管的通用思路、設計和算法。碳納米管除了末端可以修飾DNA，其側壁也是很好的結合部位。例如，Han和Deng等［79］在碳納米管上纏繞了修飾有硫醇的DNA，然后加入不同大小的納米金，使金一維排列在碳納米管上。

2009年，Maune等［80］在一個連有tile長帶的折紙矩形上特異交叉排布了兩根碳納米管。他們先用保護鏈把碳納米管上用于雜交的序列局部封閉，然后與帶有探針的矩形DNA折紙混合，可以使碳納米管結合在折紙基底上。他們發(fā)現(xiàn)用這種方法可以產生具有場效應晶體管（FET）特性的器件。這種用DNA排布碳納米管來制作納米電路的方法盡管目前效率不高，但其精確性和并行性卻是傳統(tǒng)光刻技術所不能比擬的。

2.5 藥物遞送

眾所周知，在當今人類面對癌癥等多種重大疑難疾病的挑戰(zhàn)時，傳統(tǒng)的藥物存在著諸多亟需克服的缺點，而新藥的開發(fā)又代價高昂。為了改善這些既有藥物的性能，發(fā)展合適的藥物遞送系統(tǒng)就成為了當前生物醫(yī)藥領域的迫切需求和研究熱點。近幾十年來，隨著納米技術的興起，多種納米材料都被用于藥物遞送的研究，如陽離子脂質體、聚合物、各種金屬納米顆粒、碳納米管等。但是，這類載體通常存在不容忽視的安全問題，如細胞毒性和臟器累積毒性等。而DNA納米結構作為近年來興起的一類新型的納米材料，在生物醫(yī)學領域也有著其它材料不可比擬的優(yōu)勢：（1）DNA本身作為生命的遺傳物質材料普遍存在于生物體內，而外源DNA在生物體內則可被降解利用，因此幾乎沒有生物相容性、細胞毒性和累積毒性的問題。（2）DNA分子合成和化學修飾技術已經(jīng)較為成熟和商業(yè)化，便于我們在DNA納米結構上進行各種功能化修飾，從而拓展DNA納米結構的功能，并且能在同一個結構上實現(xiàn)多種功能的組合。作為藥物載體，這樣的特點有利于實現(xiàn)藥物靶向、多藥物協(xié)同載運和藥物控制釋放等功能。（3）更重要的是，由于DNA基于堿基互補配對帶來的精確性和可編程性，我們可以對DNA納米結構的外形、尺寸、價態(tài)等性狀進行精確調控，獲得高度定制化和有序化的“智能”載體，最終實現(xiàn)診療一體化的“納米醫(yī)生”。

但是，DNA納米結構用作藥物載體還有一大關鍵問題，帶負電荷的DNA分子在形成納米結構之后，能否穿過同樣帶負電荷的細胞膜進入細胞。在常規(guī)的細胞轉染核酸分子的操作中，我們通常需要帶正電荷的轉染試劑（主要是陽離子脂質體聚合物）幫助外源核酸分子被細胞攝取。但是，2011年，Turberfield團隊［81］和樊春海研究組［82］都觀察到，納米DNA四面體結構可在不需要借助任何特異配體或轉染試劑的情況下被活細胞攝取。Sleiman團隊［83］也報道了滾環(huán)擴增（RCA）組裝的管狀DNA納米結構有較高的細胞攝取率。這些研究表明，與非結構化的線性核酸分子不同，有一定剛性和密實度的DNA納米結構本身可被細胞主動攝取。樊春海研究組對熒光標記的DNA四面體為研究對象進行了單顆粒追蹤，觀察了它被哺乳細胞攝取的過程，說明了該類型DNA納米結構可以通過能量依賴的細胞主動攝取進入細胞［84］。這些研究結果為DNA納米結構直接作為藥物遞送載體的可能性提供了支持。以下介紹DNA納米結構在藥物遞送領域的一些應用。

2.5.1 小分子藥物遞送 小分子藥物，尤其是像阿霉素、順鉑、紫杉醇這樣的腫瘤治療藥物，通常對機體正常組織和細胞也有很高的毒性，副作用極強。并且，反復使用這類藥物容易使目標腫瘤細胞產生多藥耐藥性（MDR），降低藥物的治療效果。因此，發(fā)展這類針對小分子藥物的藥物遞送系統(tǒng)，改善這類藥物的缺陷就顯得很有意義。例如，阿霉素就是這類藥物中的一個典型代表，它可以通過嵌入DNA雙螺旋結構抑制其復制和表達，因此對腫瘤細胞有明顯的殺傷效果。然而，它的選擇性較差，有明顯的毒副作用，也容易因為細胞的耐藥性而失去效果。值得注意的是，由于阿霉素具有可嵌入DNA雙鏈的特性，DNA納米結構就顯得尤其適合用于阿霉素轉運。在這一研究方向，丁寶全教授的研究組已經(jīng)取得了較大的進展［85，86］，他們利用DNA折紙結構實現(xiàn)了對阿霉素分子的高效裝載（圖3-A）。研究表明，DNA折紙結構可以將阿霉素分子釋放到具有耐藥性的腫瘤細胞內，從而殺死那些在同等濃度條件下游離阿霉素分子無法殺死的腫瘤細胞。并且，在動物實驗中，這些載帶阿霉素的DNA折紙結構可以通過腫瘤的“穿透性與滯留性增強”（EPR）效應聚集在小鼠的腫瘤部位，從而有效地抑制腫瘤生長。而Hogberg團隊［87］則研究了不同扭轉角度的DNA折紙結構轉運阿霉素到3種不同的乳腺癌細胞系中的效果。他們發(fā)現(xiàn)，通過調節(jié)DNA結構的扭轉角度可以調節(jié)藥物的載帶量及藥物的釋放動力學，實現(xiàn)可預定義的藥物釋放。

2.5.2 核酸分子遞送 與小分子藥物相比，核酸分子藥物，如CpG（“胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤”）核酸、反義核酸（如反義DNA、小干擾RNA、微小RNA等）、核酸適配體（Aptamer）等，因其較高的選擇性和較低的副作用，顯示出了良好的臨床應用前景。這些核酸藥物的傳統(tǒng)遞送策略包括對核酸分子進行化學修飾、利用陽離子轉染試劑幫助其進入細胞等。近年來，用DNA納米結構來載帶核酸分子也了吸引研究者們的關注。因為，載體與載荷都是核酸分子，它們之間只需要通過堿基互補配對就可以很便利地進行雜交連接，這就省卻了將載體和載荷分子進行化學偶聯(lián)的麻煩。與通過非共價吸附載帶藥物的方式相比，這樣的連接又可以對核酸藥物分子的空間排布進行更精確的控制，使其作用更具確定性。例如，研究發(fā)現(xiàn)，未甲基化的“胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤”（CpG）序列的寡核苷酸可被哺乳動物免疫細胞識別并激活免疫應答反應，因此可以作為一種有效的免疫激活藥物或疫苗佐劑用于各種免疫相關疾病（包括傳染疾病、癌癥等）的治療。然而，在生理條件下，天然的CpG寡核苷酸會很容易被核酸酶降解，也很難直接進入細胞達到目標位置發(fā)揮作用。因此，近年來，研究者們報道了多種利用DNA納米結構載帶CpG寡核苷酸的策略。這其中包括：Nishikawa等采用的Y-形［88］、X-形等“多足形”DNA結構［89］和以這些結構為單元組裝的更大尺度的樹枝狀結構［90］乃至水凝膠結構［88］，樊春海研究組［82］和顏灝研究組［91］相繼報道的DNA四面體結構（圖3-B），以及更大尺度的基于DNA折紙術的納米管［92］、納米帶［93］等結構。這些研究工作的結論表明，與游離的CpG核酸分子相比，引入DNA納米結構之后，CpG核酸的穩(wěn)定性普遍增加了，免疫細胞對于CpG核酸的攝取效率顯著提高了，對于細胞的免疫激活能力也大大增強了。這種性能改變與DNA納米結構帶來的尺寸變化相關。因此，DNA納米結構對于CpG核酸而言無疑是一種較為理想的載體。此外，DNA納米載體在載帶CpG核酸的同時還可以共載運其它的藥物分子，如疫苗［91］（圖3-C）和阿霉素［88］，發(fā)揮CpG免疫佐劑的功能來強化其它藥物的效力，獲得了比單獨使用這些藥物更好的效果，為多藥物共遞送和聯(lián)合治療提供了借鑒。

另外一類引起廣泛重視的核酸藥物是小干擾RNA（siRNA），這類RNA分子可以有選擇性且高效率地沉默目標基因的表達，即RNA干擾（RNAi）作用，因此在基因治療領域被寄予厚望。但是，未經(jīng)化學修飾的RNA分子同樣存在極易被降解、體內半衰期很短，難以進入細胞等難題。2012年，來自哈佛醫(yī)學院的Anderson教授等研究者們成功地將DNA四面體作為載體載帶siRNA進入小鼠體內的腫瘤細胞當中，并實現(xiàn)了靶向基因的沉默（圖3-D）。在他們的策略當中，siRNA通過序列互補雜交連接到四面體側面伸出的DNA手臂鏈上，其誘導RNA干擾的效果依然不受影響，說明了DNA納米結構用于siRNA載帶的可行性。

2.5.3 “智能化”藥物遞送 除了起到保護并幫助藥物分子到達靶位點的作用之外，理想的藥物遞送載體還應該更加“智能化”，能夠實現(xiàn)藥物靶向遞送并根據(jù)環(huán)境因素或外部刺激控制藥物釋放，最終成為“診斷-治療一體化”的“納米醫(yī)生”。近年來，DNA自組裝納米結構在這一領域也逐漸嶄露頭角。

載體的主動靶向性，通常是通過在載體上偶聯(lián)適當?shù)呐潴w，如多肽、抗體、核酸適體等實現(xiàn)的。這些配體能與靶細胞內部或表面的一些高表達的受體結合，從而使得載體在該細胞處有選擇性地富集并發(fā)揮作用。因為DNA納米結構的高度可編程性和可尋址性，DNA納米結構可以精確控制靶向配體在其結構上的空間排布、朝向和密度等參數(shù)，因此尤其適合用于靶向性載藥的研究。在DNA四面體用于siRNA遞送的研究工作中［94］，研究者們引入了葉酸分子作為靶向配體，因為葉酸受體在許多癌細胞系中都是過量表達的。研究結果表明，這些葉酸修飾的DNA載體展現(xiàn)出很強的靶向效應，能夠有選擇性地在腫瘤中富集并產生基因沉默效果；而未修飾葉酸分子或者葉酸分子朝向不合適的載體則不能發(fā)揮預期的效果。譚蔚弘教授的研究組［95，96］則利用帶有核酸適配體序列的DNA納米自組裝結構載運阿霉素或反義核酸，使藥物獲得了針對特定的白血病細胞株的靶向性（圖3-E）。

圖3 DNA納米自組裝結構在藥物遞送領域的應用研究

另一方面，依賴單一的受體-配體相互作用帶來的靶向性，其選擇性往往是不足的，這就需要引入多個判定條件增加靶向的可靠性。于是，“邏輯門”對多個條件進行判定的原理就可以被研究者們用到靶向可控的藥物釋放上，這就是“智能藥物”的思路。而DNA納米結構的眾多優(yōu)點也為構造這樣的智能遞送系統(tǒng)提供了可能。2012年，Church研究組［97］的研究者們利用一種可開合的DNA納米匣子實現(xiàn)了由邏輯門控制的藥物載體。這個匣子由兩個包含了不同核酸適配體的“鎖扣”控制，只有當環(huán)境中這兩種核酸適配體所針對的靶標分子——相當于兩把鑰匙——同時存在并觸發(fā)核酸適配體的構型變化時，兩個鎖扣才能打開，從而使匣子內部的載荷分子得以暴露在外（圖3-F）。這樣，研究者們獲得了一種由邏輯“與”門控制的，只有當兩種條件同時滿足時才能觸發(fā)藥物分子釋放的智能藥物載體。這種開合自如的出眾特色得益于DNA納米結構的精確可控性，這一成果展示了DNA納米結構在智能化藥物領域的巨大潛力。

3 結語

綜上可見，DNA納米技術在近20年間獲得了飛躍式的發(fā)展。從技術演進趨勢來看，基于DNA自組裝人工構建的結構已經(jīng)從簡單的一維或無定型結構發(fā)展到了精確可定義的復雜三維結構，從靜態(tài)結構發(fā)展到了可控的動態(tài)結構，研究者們也從最初單純的結構設計逐漸向功能探索方向深入。在對于DNA納米結構的功能研究上，從對其它材料或分子的空間排布的控制，到納米反應器的構建，再到智能化的分子診斷和藥物遞送，DNA納米技術也走過了一條優(yōu)美的發(fā)展路徑。目前，DNA納米技術的廣泛應用還面臨一些挑戰(zhàn)。例如，DNA大規(guī)模合成的成本仍然偏高，組裝復雜DNA納米結構的純度和產率還有待提高［98］。但是，我們認為，憑借化學合成技術和生物技術的發(fā)展進步，DNA微陣列合成術［99］和細胞內的DNA生物合成［100］這樣的手段可以為DNA納米結構的組裝提供新的方法，改進后的電泳［101］、超速離心［102］和高效液相色譜等手段［103］也可以用于優(yōu)化DNA納米結構的產率，更加精巧、復雜、智能化的DNA納米結構還將層出不窮。并且為克服這些挑戰(zhàn)付出的努力也是值得的，因為DNA納米結構的尺度正好處于生物大分子相互作用產生復雜生命活動的尺度范圍內，在可以預見的未來，我們相信DNA納米技術本身也還將更加緊密地與生物醫(yī)學、系統(tǒng)生物學與合成生物學相互交叉結合，使人們通過對DNA結構的設計更加深入地介入到生命活動最基本的層級當中，從而幫助人們更加深刻地理解生命活動的機制。

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Advances on Self-Assembled DNA Nanostructures

Yu Yang1Li Jiang2Zhang Zhao3Fan Chunhai2
（1. Department of Electronic Information，Shanghai Institute of Scientific Management，Shanghai 201800；2. Shanghai Institute of Applied Physics，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201800；3. Department of Chemistry，Aarhus University，Aarhus 8000，Denmark）

Studies on self-assembled DNA nanostructures have achieved great progress in recent decades. In this article, we introduced the general principles of DNA nanostructures and the history of their development. Their features and advantages are also summarized. Their applications in biosensing, nanoreactors, nanoscale spatial arrangement, nanorobots, and drug delivery have been reviewed. The future of DNA nanotechnology has also been prospected.

DNA origami；nanomachine；nanodrug

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.011

2015-02-04

國家自然科學基金項目（B050902）

俞洋，女，碩士，研究方向：DNA計算及DNA納米技術；E-mail：daizy1111@hotmail.com

樊春海，男，博士，研究方向：生物傳感、生物成像及DNA納米技術；E-mail：fchh@sinap.ac.cn