許鍇 陳霞 高紹榮

（同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092）

我國誘導(dǎo)多能干細胞研究進展

許鍇 陳霞 高紹榮

（同濟大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092）

關(guān)于細胞重編程問題的探討可以追溯至20世紀(jì)30年代。從漢斯·斯佩曼提出“胚胎誘導(dǎo)”概念開始，到20世紀(jì)60年代，約翰·戈登成功獲得了經(jīng)過體細胞核移植發(fā)育而來的爪蟾，再到1996年世界首例克隆哺乳動物克隆羊“多莉”的誕生，生物學(xué)家終于證實了高等動物的體細胞核能夠通過核移植的方式重新建立多能性，但這一方法面臨著很多社會倫理學(xué)問題，無法應(yīng)用于醫(yī)學(xué)實踐。直到2006年Yamanaka小組誘導(dǎo)多能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPS 細胞），成功地繞過了這些倫理問題，誘導(dǎo)重編程才成為了當(dāng)今干細胞生物學(xué)最為熱門的研究方向。在誘導(dǎo)多能干細胞領(lǐng)域，我國一直位居世界前列，近年來更是在iPS技術(shù)的優(yōu)化、機制研究和應(yīng)用研究等方面作出了令世界矚目的貢獻，就這幾方面做一綜述。

誘導(dǎo)性多能干細胞；體細胞重編程；表觀遺傳學(xué)；機制；重編程臨床應(yīng)用

從2006年Yamanaka課題組利用導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子成功地將小鼠成纖維細胞誘導(dǎo)為多能性細胞［1］開始，我國的體細胞重編程領(lǐng)域就一直緊跟國際一流水平，取得了很多富有價值的研究成果。自2008年以來，我國科學(xué)家建立了多種哺乳動物iPS細胞系。例如，鄧宏魁實驗室建立了恒河猴的iPS細胞系［2］，肖磊實驗室建立了大鼠和綿羊的iPS細胞系［3］，肖磊與裴端卿實驗室相繼報道建立了豬的iPS細胞系［4，5］等。在人類體細胞誘導(dǎo)重編程方面同樣取得了一系列重大成果。例如，金穎實驗室以人成纖維細胞作為滋養(yǎng)層細胞，在無LIF條件下建立了神經(jīng)前體細胞誘導(dǎo)的iPS細胞［6］；我們實驗室建立了β-地中海貧血患者的iPS細胞系［7］等。在驗證iPS細胞全能性方面，我們實驗室［8］與中國科學(xué)院動物研究所周琪研究員［9］同時報道利用四倍體囊胚互補技術(shù)得到了完全由iPS細胞發(fā)育而來的小鼠，首次證明了iPS細胞具有真正的全能性；該研究成果被評選為《時代周刊》2009年十大醫(yī)學(xué)突破之一。在iPS細胞分化為成體細胞的研究領(lǐng)域中，鄧宏魁課題組將人的iPS細胞成功誘導(dǎo)為胰島β細胞和肝細胞［10，11］。這些工作為我國的iPS領(lǐng)域的發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)，目前的研究主要集中在iPS誘導(dǎo)體系的優(yōu)化、iPS機制研究和iPS技術(shù)的臨床應(yīng)用研究三方面，本文將著重從這幾個角度介紹近幾年我國在iPS領(lǐng)域的研究進展。

1 iPS細胞的誘導(dǎo)體系及方法優(yōu)化

在iPS技術(shù)的發(fā)展過程中，iPS細胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生效率和產(chǎn)生的細胞克隆質(zhì)量曾一度是該領(lǐng)域的熱點問題。要解決iPS技術(shù)的應(yīng)用難題就要能夠高效率地獲得高質(zhì)量的iPS細胞克隆。這種高質(zhì)量主要體現(xiàn)在分化為各種成體組織與器官的多能性，以及無致癌性和無衰老傾向的安全性方面。

1.1 Yamanaka四因子的經(jīng)典iPS細胞誘導(dǎo)體系

在iPS技術(shù)出現(xiàn)初期，Yamanaka誘導(dǎo)因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc（OSKM）是誘導(dǎo)重編程領(lǐng)域的明星因子。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)OSKM四因子誘導(dǎo)出的iPS克隆分化能力有限，在裸鼠體內(nèi)形成畸胎瘤的能力較差，且只有極少數(shù)的iPS細胞克隆能夠通過四倍體囊胚互補試驗得到完全由iPS細胞發(fā)育而來的小鼠（又稱all-iPS小鼠）。值得注意的是得到的all-iPS小鼠及其子代小鼠更容易罹患腫瘤?，F(xiàn)在認為，造成這一問題的主要原因在于導(dǎo)入的兩個原癌基因c-Myc和Klf4在重編程完成后仍有少量表達［8，9，12］。針對這一問題，生物學(xué)家主要應(yīng)用兩種策略對這種傳統(tǒng)iPS細胞誘導(dǎo)方法進行優(yōu)化，一種策略是將c-Myc基因從誘導(dǎo)體系中去掉，僅利用OSK三因子進行iPS細胞的誘導(dǎo)；另一種策略則是放棄病毒載體，應(yīng)用非整合型載體等方法進行iPS細胞的誘導(dǎo)。這兩種方案雖然在一定程度上提高了應(yīng)用Yamanaka因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的iPS細胞的安全性，但是仍然未能解決這種因子組合產(chǎn)生的iPS細胞的多能性較差的問題。因此，很多課題組將注意力放在如何優(yōu)化iPS細胞的誘導(dǎo)體系或方法上來。其中具有代表性的方法是用不同的轉(zhuǎn)錄因子部分或全部替代Yamanaka的四因子誘導(dǎo)體系；另一種方法則是運用小分子化合物減少轉(zhuǎn)錄因子的使用，從而避免外源轉(zhuǎn)錄因子錯位的時空性表達對iPS細胞質(zhì)量的影響。

1.2 替代OSKM四因子的研究進展

從理論上講，轉(zhuǎn)入體細胞的轉(zhuǎn)錄因子能夠激活一些特定基因的表達，并通過復(fù)雜的調(diào)控最終建立細胞的多能性狀態(tài)，而這些轉(zhuǎn)入的外源因子會逐漸沉默，這說明轉(zhuǎn)錄因子在體細胞重編程過程中的作用實際上是通過啟動特定基因群實現(xiàn)的。鑒于此，人們開始考慮是否能夠通過替換OSKM四因子中的一個或多個得到更多更好的iPS細胞。

一開始，生物學(xué)家將注意力主要放在如何替換原癌基因Klf4上，研究發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白家族（Bone morphogenetic proteins，BMPs）能夠替代Klf4［13］，其作用機制主要是促進體細胞誘導(dǎo)重編程過程中體細胞從間充質(zhì)樣狀態(tài)到上皮樣狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，而這種轉(zhuǎn)換被認為是體細胞誘導(dǎo)重編程起始的標(biāo)志性事件。

隨著替代研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)Oct4在誘導(dǎo)體細胞重編程過程中起到中心的作用，雖然Nr5a2能夠替代Oct4而與其他Yamanaka因子誘導(dǎo)體細胞重編程，但是Nr5a2的作用仍然是作為Oct4的上游調(diào)控因子啟動Oct4的表達［14］。然而，有趣的是Oct4缺失的卵子能夠?qū)⒊衫w維細胞重編程為多能性細胞［15］，這表明Oct4在體細胞重編程過程中并不是必須的，因此推測應(yīng)當(dāng)存在不依賴于Oct4的重編程因子組合。隨后，這些因子組合逐漸被發(fā)現(xiàn)。例如，本實驗室建立的Tet1替代Oct4的體細胞重編程體系能較高效地對體細胞進行重編程［16］，并且獲得的iPS克隆能夠高效地形成四倍體囊胚互補小鼠，這表明這種因子組合大大提高了iPS細胞的多能性。這種iPS細胞質(zhì)量的提升主要依賴于Tet1這種雙加氧酶，它能夠把5-甲基化胞嘧啶氧化為5-羥甲基化胞嘧啶，從而使起始體細胞重編程過程中的DNA主動去甲基化過程，建立起多能性細胞所特有的基因組低甲基化的特征。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，僅利用Oct4和Tet兩個轉(zhuǎn)錄因子也能夠使體細胞發(fā)生重編程，并且這種組合產(chǎn)生的iPS細胞具有非常高的四倍體囊胚互補小鼠的產(chǎn)生效率［17］，隨后對小鼠的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)這種完全由Oct4/Tet1 iPS細胞形成的小鼠腫瘤發(fā)生率極低，且壽命與對照組小鼠無明顯差異。這表明這種iPS細胞的多能性以及安全性較經(jīng)典Yamanaka因子都有明顯的提高，同時也印證了DNA的去甲基化與iPS細胞的質(zhì)量具有很高的相關(guān)性。

1.3 降低iPS技術(shù)基因整合風(fēng)險的研究

對于轉(zhuǎn)錄因子隨機整合的不安全性，科學(xué)家提出了多種解決方案。2008年，Konrad Hochedlinger小組利用非整合性的腺病毒載體導(dǎo)入經(jīng)典的Yamanaka因子，成功得到了iPS細胞［18］。同年，Yamanaka小組也通過多次瞬時轉(zhuǎn)染的方法得到了iPS細胞［19］。2009年，兩個團隊同時報道使用piggyBAC轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能夠成功對小鼠和人類的成纖維細胞進行重編程［20，21］。同年，兩個實驗室報道了直接向細胞中轉(zhuǎn)入重編程蛋白質(zhì)因子使其獲得多能性的工作，其中丁勝課題組在添加丙戊酸的條件下將融合了穿膜信號肽11R的OSKM四因子或OSK三因子導(dǎo)入小鼠的成纖維細胞使其成功重編程［22］；而Kim課題組使用的是帶有穿膜信號肽9R的OSKM四因子，成功地將新生兒的成纖維細胞誘導(dǎo)為多能細胞［23］。2010年，Yakubov等［24］成功將Oct4、Sox2、Lin28和Naong成熟mRNA導(dǎo)入人類的成纖維細胞，得到了iPS細胞。2011年，Mori小組運用成熟雙鏈microRNA成功將小鼠和人類的體細胞誘導(dǎo)為iPS細胞［25］。2014年，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的吳森教授與美國猶他大學(xué)的科研人員合作首次獲得了高質(zhì)量的無外源基因整合的小鼠iPS細胞，吳教授［26］通 過 將Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、Nr5a2、microRNA302/367和正負篩選標(biāo)記基因構(gòu)建到一個非整合型質(zhì)粒上，在獲得iPS細胞后通過負篩選標(biāo)記去除殘留有該質(zhì)粒的細胞以達到確保無外源基因插入。雖然這些方法能夠在極大限度上降低外源基因隨機整合的幾率，但這些方法或多或少都會存在一些問題。例如，運用腺病毒載體或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)并不能確保完全沒有外源基因的整合；轉(zhuǎn)錄因子蛋白直接誘導(dǎo)的方法往往存在效率極低、需要不斷補充外源蛋白因子等問題。

1.4 體細胞核移植技術(shù)對iPS技術(shù)的啟示

自iPS誕生以來，iPS技術(shù)與體細胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)的孰優(yōu)孰劣的問題就一直縈繞在科學(xué)家的頭腦中，根據(jù)以往的研究來看，應(yīng)用減數(shù)分裂中期次級卵母細胞（metaphase II，MII）作為體細胞核受體的SCNT技術(shù)產(chǎn)生的多能性細胞可能比通過iPS技術(shù)得到的多能性細胞具有更好的性質(zhì)。最近，本實驗室發(fā)表在《Cell Stem Cell》雜志上的文章報道了核移植技術(shù)在增長端粒長度方面比iPS技術(shù)更有優(yōu)勢［27］。我們通過建立端粒酶敲除小鼠的核移植胚胎干細胞系（NTESC）和iPS細胞系來模擬建立人類衰老病人的多能性細胞系。對兩種多能性細胞系的端粒長度進行測定發(fā)現(xiàn)NT-ESC的端粒長度明顯增長，而iPS細胞系的端粒長度增長不明顯，這就提示了利用傳統(tǒng)iPS技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的多能性細胞可能存在端粒長度過短的風(fēng)險。而人類的端粒長度要明顯短于小鼠的，因而端粒長度過短對人類的影響可能更加嚴(yán)重。這些問題的存在促使生物學(xué)家尋找卵母細胞中存在的更優(yōu)質(zhì)的iPS因子［28-32］，例如，今年發(fā)表在《Science》雜志的一篇文章就指出，在人類MII細胞中特異性高表達的組蛋白伴侶蛋白ASF1A對人類iPS細胞的誘導(dǎo)是必要的；而且通過向人類皮膚成纖維細胞中導(dǎo)入ASF1A和OCT4能夠在添加卵細胞特異性旁分泌因子GDF9的培養(yǎng)條件下得到iPS細胞［33］。這一研究提醒人們，除了在胚胎干細胞中高表達的因子能夠?qū)w細胞進行重編程外，未受精的MII細胞中高表達的因子也能應(yīng)用于iPS技術(shù)，并可能取得更加優(yōu)化的iPS細胞系。實際上，我們實驗室對這一問題也開展了進一步的研究，我們通過對受精卵進行3次顯微操作對比了受精卵的雌雄原核的重編程能力［34］。首先，將處于間期的受精卵去掉雄原核或雌原核，將單倍體的受精卵繼續(xù)培養(yǎng)，阻滯在有絲分裂的中期并去除紡錘體及染色體，再把供體細胞的核物質(zhì)注入到去核的受精卵中繼續(xù)培養(yǎng)或移植到代孕母鼠體內(nèi)。研究結(jié)果表明，去除雌原核的單倍體小鼠受精卵可以獲得由胚胎干細胞作為核供體的克隆小鼠，并且支持體細胞核移植克隆胚胎發(fā)育至囊胚，并建立具有多能性的核移植胚胎干細胞系；而去除雄原核的受精卵則無法支持體細胞克隆胚胎發(fā)育到囊胚。對這兩種克隆胚胎的表觀遺傳標(biāo)記檢測表明，雌雄原核表現(xiàn)出對體細胞的不同表觀遺傳重編程能力，去除雄原核的受精卵不能正確重編程體細胞。而通過在受精卵中融合入一個額外的雄原核顯著提高了核移植的效率，這進一步證明了雄原核中確實存在對體細胞重編程至關(guān)重要的效應(yīng)因子，并且提示我們可以從雄原核中尋找促進體細胞重編程的因子。

1.5 化學(xué)小分子iPS細胞的建立

基于轉(zhuǎn)錄因子的iPS技術(shù)主要存在兩個關(guān)鍵的安全性問題，其一為隨機整合的外源DNA片段會影響基因組的自有結(jié)構(gòu)，并可能影響相關(guān)基因的表達情況，而且這種影響具有可遺傳性和永久性，這一問題僅針對病毒載體而言；其二為不正常的基因表達水平和不同細胞間的基因表達差異可能會導(dǎo)致細胞基因表達上的紊亂及增加細胞之間的異質(zhì)性。而小分子化合物組合誘導(dǎo)體細胞重編程，因其無需轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子的特點而成功避開了iPS技術(shù)安全性的兩個關(guān)鍵問題，并因此得到了全世界的矚目。

在獲得并培養(yǎng)小鼠或人類的胚胎干細胞的嘗試中，生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)添加一些小分子化合物能夠提高胚胎干細胞的建系效率，并提升其生長狀態(tài)，進一步研究發(fā)現(xiàn)這些小分子物質(zhì)主要參與了調(diào)控胚胎干細胞的多能性的細胞信號通路。因此，相同的思路可以用來提高iPS細胞產(chǎn)生效率和質(zhì)量甚至優(yōu)化iPS技術(shù)。例如，對胚胎干細胞的多能性維持具有重要作用的Gsk3β的抑制劑CHIR-99021和MEK抑制劑PD-0325901能夠提高重編程效率［35］。另一種尋找有利于重編程的化學(xué)小分子的路徑，是對多能性相關(guān)的細胞信號通路進行研究并篩選，這類小分子物質(zhì)包括上述兩種激酶抑制劑、TGFβ抑制劑［36，37］、GSK3、周期蛋白激酶抑制劑Kenpaullone［38］和mTOR細胞信號通路的抑制劑雷帕霉素［39］等。因為表觀遺傳學(xué)在重編程過程中的重要作用，生物學(xué)家同樣篩選到了一系列與表觀遺傳學(xué)修飾相關(guān)的化學(xué)小分子，如組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）的抑制劑丙戊酸（valproic acid，VPA）和著名抗癌藥物——辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoyla nilide hydroxamic acid，SAHA）［40，41］、組蛋白去甲基化酶LSD1的激活劑反苯環(huán)丙胺［42］等。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上北京大學(xué)鄧宏魁教授成功建立了只添加6種小分子化合物的誘導(dǎo)體細胞重編程體系，這一發(fā)現(xiàn)也被認為是重編程領(lǐng)域發(fā)展的里程碑事件［43］。鄧教授首先得到了只轉(zhuǎn)入Oct4，同時添加丙戊酸、GSK3-β信號通路的抑制劑、TGF-β信號通路的抑制劑和H3K4 的去甲基化抑制劑強內(nèi)心百樂明（tranylcypromine）4種小分子誘導(dǎo)出的iPS細胞［44］。同年，另一個研究團隊也報道了相似的研究成果［45］。接下來鄧教授利用轉(zhuǎn)入SKM三因子的小鼠成纖維細胞篩選能夠替代Oct4的小分子化合物，經(jīng)過對上萬種小分子進行篩選，最終確定弗斯可林（forskolin，F(xiàn)SK）、2-甲基-5-羥色胺（2-Me-5HT）和D4476s能作為Oct4的替代化合物。綜合兩個工作的成果，鄧教授經(jīng)過一系列試驗得到6種小分子，分別為丙戊酸、Repsox、強內(nèi)心百樂明、佛司可林、DZNep和CHIR-99021。進一步的研究表明，僅用其中的4種小分子CHIR-99021、FSK、616452（即Repsox）和DZNep就能完成體細胞重編程。其中CHIR、FSK和Repsox能夠激活Sall4、Sox2的表達，而DZNep能激活Oct4的表達，從而使體細胞發(fā)生重編程（圖1）。但是目前這種誘導(dǎo)體系仍然存在著誘導(dǎo)效率低（0.05%）、誘導(dǎo)周期長（6周以上）和誘導(dǎo)出的細胞多能性較差（雖然這種重編程細胞能夠形成畸胎瘤和嵌合體小鼠，但是至今沒有報道其能夠通過最為嚴(yán)格的四倍體囊胚互補試驗驗證其多能性）等問題，因而對化學(xué)小分子iPS技術(shù)的研究還將繼續(xù)下去，相信在不久的將來一定能夠獲得具有應(yīng)用價值的小分子iPS細胞。

圖1 小分子化合物重編程機制示意圖［43］

2 iPS細胞的機制研究

若使得iPS技術(shù)能夠應(yīng)用就必須對其機制進行深入研究，之前對iPS技術(shù)機制的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白質(zhì)組水平，而現(xiàn)在表觀遺傳學(xué)水平的研究無疑是最中心的問題，因為無論轉(zhuǎn)錄組還是蛋白組的改變最終都要歸因于表觀遺傳學(xué)性質(zhì)的改變。本文將主要從我國科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)的影響重編程過程中表觀遺傳特征入手對誘導(dǎo)重編程的機制進行闡述。

2.1 表觀遺傳重編程概述

根據(jù)目前的研究，表觀遺傳修飾主要包括染色體上的DNA的甲基化和羥甲基化修飾、組蛋白變體、組蛋白修飾、核小體重構(gòu)和染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，以及非編碼RNA（又分為microRNA和lncRNA）和RNA的甲基化［46-48］。這些表觀遺傳特征都與iPS技術(shù)息息相關(guān)，細胞重編程最終反映為體細胞表觀遺傳學(xué)性質(zhì)改變?yōu)槎嗄苄约毎臓顟B(tài)，即無論體細胞在外源的轉(zhuǎn)錄因子、蛋白因子還是化學(xué)小分子刺激下如何轉(zhuǎn)變形態(tài)和性質(zhì)，只要其本身的表觀遺傳特征未變或變化不到位都會導(dǎo)致這種“多能性細胞”在外源刺激被撤掉或抑制后迅速喪失多能性；并且外源重編程因子的異常刺激可能會使細胞形成錯誤的表觀遺傳特征，從而導(dǎo)致細胞類型的轉(zhuǎn)換甚至死亡。因此表觀遺傳特征的重編程才是iPS技術(shù)的核心和內(nèi)在機制。在這一領(lǐng)域，我國科學(xué)家也同樣作出了突出的貢獻。

2.2 染色質(zhì)重構(gòu)

染色質(zhì)重構(gòu)蛋白是重編程因子起作用的關(guān)鍵靶點之一，有研究表明重要的胚胎干細胞特異性染色質(zhì)重構(gòu)復(fù)合體BAF中的兩個組分Smarca4（Brg1）和Smarcc1（BAF155）能夠協(xié)同OSK三因子對成纖維細胞進行重編程［49］。這些染色質(zhì)重構(gòu)蛋白一方面增強了Oct4蛋白結(jié)合Sall4、Tcf3和Dppa4基因啟動子區(qū)的能力；另一方面增加了Oct4結(jié)合區(qū)域組蛋白H3上4號賴氨酸發(fā)生三甲基化修飾（H3K4me3）和組蛋白H3上9號賴氨酸發(fā)生乙?；揎棧℉3K9ac），而這兩種組蛋白修飾能夠使基因組上該區(qū)域呈現(xiàn)開放的狀態(tài)，從而有利于Oct4因子對其下游基因的調(diào)控［50］。2013年6月，《Cell Stem Cell》雜志上發(fā)表了吉林大學(xué)第一醫(yī)院胡繼繁、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院范先群等研究團隊［51］的研究成果：黏結(jié)蛋白復(fù)合物基因SMC1所支配的染色質(zhì)內(nèi)袢環(huán)（intrachromosomal looping）是細胞重編程過程中激活內(nèi)源性多能基因的必要條件，從而揭示了體細胞重編程誘導(dǎo)多能性一個新的關(guān)鍵性的表觀遺傳路障。該研究團隊發(fā)現(xiàn)iPS細胞與未重編程細胞中病毒載體表達的誘導(dǎo)因子結(jié)合靶基因啟動子程度一樣，但僅在iPS細胞中觀察到內(nèi)源性多能基因的表達。通過比較Oct4基因位點的局部染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，研究人員發(fā)現(xiàn)有一個黏結(jié)蛋白復(fù)合物（cohesin complex）介導(dǎo)的染色質(zhì)內(nèi)袢環(huán)存在于一個下游增強子與基因啟動子之間，促使激活了內(nèi)源干性基因。而在未重編程細胞中則沒有觀察到這樣的遠程相互作用。當(dāng)研究人員利用RNAi抑制黏結(jié)蛋白復(fù)合物基因SMC1時發(fā)現(xiàn)，其可破壞染色質(zhì)內(nèi)相互作用，影響多能性。2014年，王利博士及其同事發(fā)現(xiàn)重要的重編程因子，如Oct4能夠招募染色質(zhì)重構(gòu)ATP酶INO80，而INO80能夠進一步穩(wěn)定核小體缺乏區(qū)（nucleosomedepleted regions，NDRs）并招募中介因子（Mediator）和RNA聚合酶II（RNA polymerase II，Pol II）啟動基因的表達。這一工作解釋了一些重編程的主宰轉(zhuǎn)錄因子（master transcription factor）能夠選擇性地抑制分化基因而啟動多能性基因的現(xiàn)象［52］。

2.3 DNA主動去甲基化

在對表觀重編程的研究中，我國科學(xué)家貢獻最大的領(lǐng)域當(dāng)屬DNA主動去甲基化領(lǐng)域。相比于組蛋白修飾重建，多能性相關(guān)基因啟動子去甲基化發(fā)生于重編程的末期［53］，而這種低甲基化狀態(tài)對iPS細胞的多能性又具有決定性的作用［54］，因此，DNA去甲基化可能是體細胞重編程過程中的一個障礙，只有跨越這一障礙，細胞才能夠獲得多能性。目前的研究認為在重編程過程中主要存在兩種DNA去甲基化機制，一類是依賴于DNA復(fù)制的被動去甲基化，這種去甲基化過程相對緩慢；另一種DNA去甲基化機制是依賴于激活誘導(dǎo)型胞嘧啶核苷脫氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）［55］或Tet蛋白家族（ten-eleven translocation family）的主動去甲基化。主動去甲基化機制能夠快速并特異性地進行DNA的去甲基化，因而也更為重要。我們實驗室的研究表明，Tet1可以催化Oct4 R-DMRs區(qū)域的5hmC的產(chǎn)生，促進該區(qū)域的DNA去甲基化，進而促進重編程中Oct4的轉(zhuǎn)錄激活。進一步利用Tet1取代Oct4用以實現(xiàn)體細胞的誘導(dǎo)重編程。在證明TSKM-iPS細胞完全多能性的同時，建立了TSKM的二次重編程系統(tǒng)。在這一誘導(dǎo)體系中發(fā)現(xiàn)TSKM誘導(dǎo)的重編程可以被明顯的分為兩個階段。第一個階段是從TSKM誘導(dǎo)第0天（TSKM 0D）到第3天（TSKM 3D）。這一階段最重要的變化在于體細胞特異表觀修飾的解構(gòu)。在這一階段，Tet家族蛋白催化5mC氧化而產(chǎn)生5hmC，并隨后引發(fā)基因組上5mC與5hmC的共同上升。在誘導(dǎo)中間階段基因表達與5mC和5hmC修飾狀態(tài)的關(guān)系表明，基因組上DNA的甲基化和羥甲基化的修飾改變可能參與推動了整體表達譜的扭轉(zhuǎn)。而誘導(dǎo)的第二個階段，即TSKM 3D到iPS細胞建立，細胞內(nèi)最重要的變化在于ES樣表觀修飾的建立。而在這一階段，基因組上已經(jīng)升高的5mC需要被去除，而5hmC有的繼續(xù)上升，有的則會回落，最終形成類似于ES細胞的修飾模式（圖2）。

圖2 Tet1參與的細胞重編程過程與機制［16］

基因組水平的綜合分析表明，DNA的甲基化與羥甲基化參與了基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)和整個表達譜的改變。5mC的氧化不僅參與了重編程中的多能性基因激活，更可能在ES細胞中的活性調(diào)節(jié)區(qū)域去甲基化與表觀修飾重塑中具有重要作用。隨后徐國良課題組［56］得到了Tet蛋白家族的Tet1、Tet2和Tet3及Tdg基因敲除的小鼠成纖維細胞，并試圖對其進行重編程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種喪失了主動去甲基化能力的細胞無法啟動MET過程，因而造成了細胞重編程的失敗。進一步的研究表明，Tet或TDG的缺失主要影響了microRNA-200基因家族啟動子區(qū)的去甲基化而導(dǎo)致細胞無法進入MET過程。

2.4 組蛋白變體研究

華人科學(xué)家Xiao等［57］發(fā)現(xiàn)組蛋白變體H2A.X的分布與iPS細胞的多能性關(guān)系密切，分化能力出眾的iPS細胞中H2A.X在染色質(zhì)上呈現(xiàn)出相對集中且規(guī)則的分布，而在多能性較差的iPS細胞中則呈現(xiàn)散亂無規(guī)則的分布特點。這項研究也為評價iPS細胞的質(zhì)量提供了一個重要的標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 H3K9me3的研究

裴端卿課題組最近的研究發(fā)現(xiàn)H3K9的甲基化是小鼠體細胞重編程的主要障礙之一，裴教授課題組在進行重編程實驗時發(fā)現(xiàn)了一類外形、增殖等方面酷似多能性細胞但卻沒有相應(yīng)的基因表達譜改變和干細胞表觀遺傳特性建立的細胞，這類細胞被稱為前iPS（pre-iPSC）細胞。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，H3K9甲基化的存留是產(chǎn)生這種重編程不完全細胞的原因。通過激活維生素C依賴的H3K9去甲基化酶能夠?qū)⑦@些pre-iPS細胞幾乎全部轉(zhuǎn)化為真正的iPS細胞［58］。

在iPS技術(shù)高速發(fā)展的當(dāng)下，只有不斷加深對其內(nèi)在機制的認識才能更好地指導(dǎo)人們不斷優(yōu)化iPS的誘導(dǎo)體系，相信在不久的將來，人們終將得到符合臨床標(biāo)準(zhǔn)的iPS細胞誘導(dǎo)方式并盡快服務(wù)于臨床診斷和治療。

3 展望

在iPS技術(shù)蓬勃發(fā)展的今天，再生醫(yī)學(xué)的大門漸漸開啟，尤其是2014年，科學(xué)界在iPS技術(shù)應(yīng)用的研究領(lǐng)域取得了長足進步。日本理化所（RIKEN）發(fā)育生物學(xué)中心的眼科學(xué)家高橋雅代（Masayo Takahashi）為一位罹患退行性眼病的日本患者實施了世界首例基于iPS技術(shù)的細胞移植手術(shù)。他們利用一名70多歲的老年黃斑變性女患者的皮膚細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生了iPS細胞，并將其定向分化得到了視網(wǎng)膜色素上皮細胞，然后用外科手術(shù)的方式將其移植到該患者的受損視網(wǎng)膜區(qū)域，從而達到治療的目的。另外，來自波士頓兒童醫(yī)院的研究人員將8種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠成熟血細胞并獲得了性質(zhì)類似造血干細胞的細胞群，研究人員將這些細胞命名為誘導(dǎo)造血干細胞（Induced hematopoietic stem cells，iHSCs），這種細胞能夠分化成血液系統(tǒng)的所有細胞類型［59］。這無疑為治療白血病等惡性血液疾病提出了新的思路。另一項振奮人心的消息來自愛丁堡大學(xué)，科學(xué)家們將體外培養(yǎng)的細胞移植到小鼠體內(nèi)成功得到了具有完全功能的胸腺，胸腺是T細胞的成熟場所，對獲得性免疫具有非常重要的作用，研究人員也希望運用這種技術(shù)造福于那些嚴(yán)重免疫缺陷的患者。這一成果標(biāo)志著體外培養(yǎng)替代性器官的重大突破。最近，我國科學(xué)家也在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了重要突破，2014年2月《Cell Stem Cell》雜志發(fā)表了我國兩個課題組在建立高效制備功能成熟人類肝臟細胞方法上的突破性進展。鄧宏魁課題組［60］通過將肝臟實質(zhì)細胞特異性表達的命運決定因子與功能性成熟相關(guān)的因子轉(zhuǎn)入人類的成纖維細胞，獲得了人類誘導(dǎo)性肝臟實質(zhì)細胞（hiHepCs），這種細胞能夠在發(fā)生嚴(yán)重肝損傷的小鼠體內(nèi)高效重建肝功能，并能夠通過藥物代謝測試。而中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所的惠利健課題組［61］則通過在人類的成纖維細胞中高表達3個特異的肝臟轉(zhuǎn)錄因子，同樣獲得了可增殖的、功能成熟的hiHepCs。這兩個研究團隊在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生肝臟實質(zhì)細胞的成果將極大地促進針對肝臟疾病患者的肝細胞替代治療。這些振奮人心的成果一經(jīng)發(fā)表立即引起了全世界生命科學(xué)工作者的關(guān)注，但是應(yīng)該指出的是對iPS技術(shù)的安全性和療效的擔(dān)憂仍然存在，iPS要真正走上應(yīng)用的道路還有很多工作要做。

最近出現(xiàn)的CRISPR/Cas9基因組修飾系統(tǒng)［62］因其高效性被認為可以用于進行基因治療，尤其對于那些由基因突變造成的嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病，如β地中海貧血癥、鐮刀型細胞貧血癥等?？梢越Y(jié)合iPS技術(shù)建立患者的iPS細胞系或造血干細胞系，再運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)修復(fù)其基因組序列，從而得到具有治療價值的造細胞系，再將這種細胞系進行體外培養(yǎng)得到的相應(yīng)組織或器官移植到患者體內(nèi)從而達到治療遺傳病的目的。相信iPS技術(shù)能夠通過不斷結(jié)合新的技術(shù)得到長足的發(fā)展并最終造福于人類。

［1］ Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］. Cell, 2006, 126：663-676.

［2］ Liu HS, Zhu FF, Yonge J, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts［J］. Cell Stem Cell, 2008, 3（6）：587-590.

［3］ Li WL, Wei W, Zhu SY, et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors［J］. Cell Stem Cell, 2009, 4（1）：16-19.

［4］ Wu Z, Chen JJ, Ren JT, et al. Generation of pig induced pluripotent stem cells with a drug-inducible system［J］. J Mol Cell Biol, 2009, 1（1）：46-54.

［5］ Esteban MA, Xu JY, Yang JY, et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig［J］. J BiolChem, 2009, 284（26）：17634-17640.

［6］ Li CL, Yu HY, Ma Y, et al. Germline-competent mouse-induced pluripotent stem cell lines generated on human fibroblasts without exogenous leukemia inhibitory factor［J］. PLoS One, 2009, 4（8）：e6724.

［7］ Wang YX, Jiang YH, Liu S, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human β-thalassemia fibroblast cells［J］. Cell Res, 2009, 19（9）：1120-1123.

［8］ Kang L, Wang JL, Zhang Y, et al. iPS cells can support full-term development of tetraploid blastocyst-complemented embryos［J］. Cell Stem Cell, 2009, 5（2）：135-138.

［9］ Zhao XY, Li W, Lv Z, et al. iPS cells produce viable mice through tetraploid complementation［J］. Nature, 2009, 461（7260）：86-90.

［10］ Zhang DH, Jiang W, Liu M, et al. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulinproducing cells［J］. Cell Res, 2009, 19（4）：429-438.

［11］ Song ZH, Cai J, Liu YX, et al. Efficient generation of hepatocytelike cells from human induced pluripotent stem cells［J］. Cell Res, 2009, 19（11）：1233-1242.

［12］ Stadtfeld M, Apostolou E, Akutsu H, et al. Aberrant silencing of imprinted genes on chromosome 12qF1 in mouse induced pluripotent stem cells［J］. Nature, 2010, 465（7295）：175-181.

［13］ Chen J, Liu J, Yang J, et al. BMPs functionally replace Klf4 and support efficient reprogramming of mouse fibroblasts by Oct4 alone［J］. Cell Res, 2011, 21（1）：205-212.

［14］ Heng JC, Feng B, Han J, et al. The nuclear receptor Nr5a2 can replace Oct4 in the reprogramming of murine somatic cells to pluripotent cells［J］. Cell Stem Cell, 2010, 6（2）：167-174.

［15］ Wu G, Han D, Gong Y, et al. Establishment of totipotency does not depend on Oct4A［J］. Nat Cell Biol, 2013, 15（9）：1089-1097.

［16］ Gao Y, Chen J, Li K, et al. Replacement of Oct4 by Tet1 during iPSC induction reveals an important role of DNA methylation and hydroxymethylation in reprogramming［J］. Cell Stem Cell, 2013, 12（4）：453-469.

［17］ Chen J, Gao Y, Huang H, et al. The combination of Tet1 with Oct4 generates high-quality mouse induced pluripotent stem cells（iPSCs）［J］. Stem Cells, 2015, 33（3）：686-698.

［18］ Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration［J］．Science, 2008, 322（5903）：945-949．

［19］ Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors［J］. Science, 2008, 322（5903）：949-953.

［20］ Kaji K, Norrby K, Paca A, et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors［J］. Nature, 2009, 458（7239）：771-775.

［21］ Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al. PiggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells［J］. Nature, 2009, 458（7239）：766-770.

［22］ Zhou H, Wu S, Joo JY, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins［J］．Cell Stem Cell, 2009, 4（5）：381-384.

［23］ Kim D, Kim C, Moon J, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins［J］. Cell Stem Cell, 2009, 4（6）：472-476.

［24］ Yakubov E, Rechavi G, Rozenblatt S, et al. Reprogramming of human fibroblasts to pluripotent stem cells using mRNA of four transcription factors［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 394：189-193.

［25］ Miyoshi N, Ishii H, Nagano H, et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs［J］. Cell Stem Cell, 2011, 8（6）：633-638.

［26］ Wu S, Wu Y, Zhang X, Capecchi MR. Efficient germ-line transmission obtained with transgene-free induced pluripotent stem cells［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111（29）：10678-10683.

［27］ Le R, Kou Z, Jiang Y, et al. Enhanced telomere rejuvenation in pluripotent cells reprogrammed via nuclear transfer relative to induced pluripotent stem cells［J］. Cell Stem Cell, 2014, 14（1）：27-39.

［28］ Wakayama S, Jakt ML, Suzuki M, et al. Equivalency of nuclear transfer-derived embryonic stem cells to those derived from fertilized mouse blastocysts［J］. Stem Cells, 2006, 24：2023-2033.

［29］ Hanna J, Saha K, Pando B, et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration［J］. Nature, 2009, 462：595-601.

［30］ Assou S, Cerecedo D, Tondeur S, et al. A gene expression signature shared by human mature oocytes and embryonic stem cells［J］.BMC Genomics, 2009, 10：10.

［31］ Kim K, Doi A, Wen B, et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells［J］. Nature, 2010, 467：285-290.

［32］ Miyamoto K, Teperek M, Yusa K, et al. Nuclear Wave1 is required for reprogramming transcription in oocytes and for normal development［J］. Science, 2013, 341：1002-1005.

［33］ Gonzalez-Mu?oz E, Arboleda-Estudillo Y, Otu HH, et al. Histone chaperone ASF1A is required for maintenance of pluripotency and cellular reprogramming［J］. Science, 2014, 345（6198）：822-825.

［34］ Liu W, Yin J, Kou X, et al. Asymmetric reprogramming capacity of parental pronuclei in mouse zygotes［J］. Cell Rep, 2014, 6（6）：1008-1016.

［35］ Silva J, Barrandon O, Nichols J, et al. Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition［J］. PLoS Biol, 2008, 6：e253.

［36］ Ichida J, Blanchard J, Lam K, et al. A small-molecule inhibitor of TGF-beta signaling replaces Sox2 in reprogramming by inducing Nanog［J］. Cell Stem Cell, 2009, 5（5）：491-503.

［37］ Maherali N, Hochedlinger K. TGFbeta signal inhibition cooperates in the induction of iPSCs and replaces Sox2 and cMyc［J］. Curr Biol, 2009, 19：1718-1723.

［38］ Lyssiotis C, Foreman RK, Staerk J, et al. Reprogramming of murine fibroblasts to induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106：8912-8917.

［39］ Chen T, Shen L, Yu J, et al. Rapamycin and other longevitypromoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stem cells［J］. Aging Cell, 2011, 10：908-911.

［40］ Huangfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds［J］. Nat Biotechnol, 2008, 26：795-797.

［41］ Huangfu D, Osafune K, Maehr R, et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2［J］. Nat Biotechnol, 2008, 26：1269-1275.

［42］ Li W, Zhou H, Abujarour R, et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells in the absence of exogenous Sox2［J］. Stem Cells, 2009, 27：2992-3000.

［43］ Hou P, Li Y, Zhang X, et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds［J］. Science, 2013, 341：651-654.

［44］ Li Y, Zhang Q, Yin X, et al. Generation of iPSCs from mouse fibroblasts with a single gene, Oct4, and small molecules［J］. Cell Res, 2011, 21（1）：196-204.

［45］ Yuan X, Wan H, Zhao X, et al. Combined chemical treatment enables Oct4-induced reprogramming from mouse embryonic fibroblasts［J］. Stem Cells, 2011, 29（3）：549-553.

［46］ Allis CD, Jenuwein T, Reinberg D. Epigenetics［M］. New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2007：502-510.

［47］ Sasaki H, Matsui Y. Epigenetic events in mammalian germ-cell development：reprogramming and beyond［J］. Nat Rev Genet, 2008, 9（2）：129-140.

［48］ Meyer KD, Saletore Y, Zumbo P, et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3’ UTRs and near stop codons［J］. Cell, 2012, 149（7）：1635-1646.

［49］ Singhal N, Graumann, J, Wu G, et al. Chromatin-remodeling components of the BAF complex facilitate reprogramming［J］. Cell, 2010, 141：943-955.

［50］ Ding J, Xu H, Faiola F, et al. Oct4 links multiple epigenetic pathways to the pluripotency network［J］. Cell Res, 2012, 22：155-167.

［51］ Zhang H, Jiao W, Sun L, et al. Intrachromosomal looping is required for activation of endogenous pluripotency genes during reprogramming［J］. Cell Stem Cell, 2013, 13（1）：30-35.

［52］ Wang L, Du Y, Ward JM, et al. INO80 facilitates pluripotency gene activation in embryonic stem cell self-renewal, reprogramming, and blastocyst development［J］. Cell Stem Cell, 2014, 14（5）：575-591.

［53］ Polo JM, Anderssen E, Walsh RM, et al. A molecular roadmap of reprogramming somatic cells into iPS cells［J］. Cell, 2012, 151：1617-1632.

［54］ Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang X, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis［J］. Nature, 2008, 454：49-55.

［55］ Bhutani N, Brady JJ, Damian M, et al. Reprogramming towards pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation［J］. Nature, 2010, 463：1042-1047.

［56］ Hu X, Zhang L, Mao SQ, et al. Tet and TDG mediate DNA demethylation essential for mesenchymal-to-epithelial transition in somatic cell reprogramming［J］. Cell Stem Cell, 2014, 14（4）：512-522.

［57］ Wu T, Liu Y, Wen D, et al. Histone variant H2A. X deposition pattern serves as a functional epigenetic mark for distinguishing the developmental potentials of iPSCs［J］. Cell Stem Cell, 2014, 15（3）：281-294.

［58］ Chen J, Guo L, Zhang L, et al. Vitamin C modulates TET1 function during somatic cell reprogramming［J］. Nat Genet, 2013, 45：1504-1509.

［59］ Riddell J, Gazit R, Garrison BS, et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors［J］. Cell, 2014, 157（3）：549-564.

［60］ Du Y, Wang J, Jia J, et al. Human hepatocytes with drug metabolic function induced from fibroblasts by lineage reprogramming［J］. Cell Stem Cell, 2014, 14（3）：394-403.

［61］ Huang P, Zhang L, Gao Y, et al. Direct reprogramming of human fibroblasts to functional and expandable hepatocytes［J］. Cell Stem Cell, 2014, 14（3）：370-384.

［62］ Mali P, Yang L, Esvelt KM, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9［J］. Science, 2013, 339：823-826.

The Progress of Induced Pluripotent Stem Cells Research in China

Xu Kai Chen Xia Gao Shaorong
（School of Life Sciences and Technology，Tongji University，Shanghai 200092）

The research on somatic cell reprogramming can trace back to 1930s when Hans Spemann firstly proposed the concept of embryos induction. 30 years later, John Gurdon successfully obtained cloned Xenopus laevis through somatic cell nuclear transfer（SCNT）. Finally in 1996, the first cloned sheep Dolly was created through SCNT. This achievement clearly demonstrated that the mammalian somatic cell fates can be reprogrammed to totipotent state by SCNT. However, SCNT technology faced with both ethics issues and therapeutic application challenges. It is until the year of 2006 when Yamanaka group built up the iPS（induced pluripotent stem cells, iPS cells）technology which can bypass the ethical problems. Subsequently, the iPS technology has become the most popular research topic in stem cell field. In this particular research field, the scientists in China has made great contributions especially in the optimization iPS technology, mechanism studies and the application of iPS technology in translational medical research. In this review, the major progresses made by our countries’ scientists in iPS field are summarized.

induced pluripotent stem cell；reprogramming；epigenetics reprogramming；mechanism；clinical application

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.006

2015-01-03

許鍇，男，碩士研究生，研究方向：干細胞與表觀遺傳學(xué)；E-mail：xukai_0925@163.com

陳霞，女，碩士研究生，研究方向：干細胞與表觀遺傳學(xué)；E-mail：chenxia_925@163.com

高紹榮，博士，教授，研究方向：干細胞與表觀遺傳學(xué)；E-mail：gaoshaorong@#edu.cn