劉曉波，李 淼，岑 靜，李潤成

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128）

皮膚軟組織化膿性感染是由于細(xì)菌侵入皮膚而發(fā)生的炎癥反應(yīng)，局部可出現(xiàn)紅、腫、熱、痛和功能障礙，嚴(yán)重時細(xì)菌及毒素進(jìn)入血液循環(huán)可引起毒血癥或敗血癥,傷口感染是細(xì)菌在體內(nèi)大量繁殖的結(jié)果，膿是機(jī)體組織炎癥過程中形成的濃稠或稀薄的滲出物，其中包含變性、壞死的白細(xì)胞、細(xì)菌、壞死組織碎片和滲出的組織液。為了解豬場內(nèi)生豬體內(nèi)外膿包形成原因，筆者從不同規(guī)模的豬場、采集生豬不同部位的膿包樣本，進(jìn)行細(xì)菌分離、鑒定，并將測出的分離菌16SrRNA 基因與GenBank 登錄的序列進(jìn)行Blast 比對分析。 意圖對膿包形成的主要病原，進(jìn)行調(diào)查分析，為豬場預(yù)防膿包形成提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

巧克力瓊脂培養(yǎng)基購自江門市凱林貿(mào)易有限公司，DNA 聚合酶、DNTP 購自北京天根生物化學(xué)科技有限公司。

1.2 病料樣本的采集

從不同豬場， 主要以保育豬和肥豬為采樣對象，發(fā)現(xiàn)膿包首先進(jìn)行臨床觀察并就膿包形成的原因向畜主展開調(diào)查，然后用一次性滅菌注射器無菌采取生豬體表膿包的膿汁樣品或直接將有發(fā)膿灶的組織樣品帶回試驗(yàn)室備用。

1.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢

取采回的膿汁或帶有發(fā)膿灶的病料組織劃線接種巧克力培養(yǎng)基， 并放于37℃恒溫箱培養(yǎng)36h后，挑取菌落革蘭氏染色鏡檢。

1.4 分離菌16SrRNA基因的擴(kuò)增與測序、Blast分析

參照文獻(xiàn)[1]合成細(xì)菌16SrRNA 基因的通用引物， 然后以分離的細(xì)菌為模板進(jìn)行16SrRNA PCR擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增方法按常規(guī)進(jìn)行。 將PCR 產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序， 并將測出序列于NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行Blast 分析確定分離菌為何種細(xì)菌,最后將測出序列與GenBank 登錄的相同細(xì)菌序列用DNASTAR 生物軟件進(jìn)行同源性比對，衡量測出序列與已登錄序列的同源性。

2 結(jié)果

2.1 病料采集結(jié)果

從不同豬場， 主要以保育豬場和肥豬為采樣對象，發(fā)現(xiàn)膿包首先進(jìn)行臨床觀察并就膿包形成的原因向畜主展開調(diào)查，然后無菌采取生豬體表或體內(nèi)膿包的膿汁樣品帶回試驗(yàn)室備用。結(jié)果從3 個豬場共采集了7 個不同來源的膿包樣本， 其中頸部皮下膿包4個、耳朵膿包1 個、實(shí)質(zhì)臟器發(fā)膿灶樣本2 個。不同豬場臨床觀察及膿包形成原因調(diào)查情況如下。

2.1.1 豬場一：湖南省長沙縣某豬場、豬場管理水平一般。保育豬健康水平較好，筆者前去調(diào)查采樣時，120 頭保育豬當(dāng)中發(fā)現(xiàn)有1 頭保育豬頸部皮下有一拳頭大小的膿包（見圖1）。 畜主反應(yīng)膿包形成原因可能與接種口蹄疫疫苗有關(guān)。

2.1.2 豬場二：湖南省長沙縣某豬場、豬場管理水平較差。 保育豬健康水平不理想，保育豬轉(zhuǎn)到肥豬欄不久的架子豬，部分出現(xiàn)呼吸困難癥狀，神經(jīng)癥狀，不能站立，發(fā)病死淘率在5%～10%左右。 筆者前去調(diào)查采樣時，解剖了4 頭轉(zhuǎn)入肥豬欄不久的架子豬，發(fā)現(xiàn)有1 頭豬的肝、脾臟組織有白色發(fā)膿灶（見圖2、圖3）。 畜主不清楚發(fā)膿灶形成的原因。

圖2 架子豬肝臟發(fā)膿灶

圖3 架子豬脾臟發(fā)膿灶

2.1.3 豬場三：湖南省衡陽市某豬場、豬場管理水平差。保育豬健康水平補(bǔ)理想，筆者前去調(diào)查采樣時，200 頭保育豬當(dāng)中發(fā)現(xiàn)有22 頭保育豬耳朵或頸部長有膿包（代表性圖片見圖4、圖5）。 通過畜主反映，頸部皮下膿包形成可能與接種油乳劑細(xì)菌滅活疫苗有關(guān)，耳朵可能與轉(zhuǎn)群后豬群打斗有關(guān)。

圖4 保育豬耳朵膿包

圖5 保育豬頸部膿包

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鏡檢結(jié)果

取采回的膿汁或帶有發(fā)膿灶的病料組織劃線接種巧克力培養(yǎng)基，并放于37℃恒溫箱培養(yǎng)36 小時后，挑取菌落革蘭氏染色鏡檢。結(jié)果所有分離菌，菌落形態(tài)可分為2 種。 1 號菌在平皿上生長為圓形、光滑、表面凸起、灰白色、針尖狀菌落，周圍有融血的菌落；革蘭氏染色陽性。 2 號菌在平皿上生長為圓形凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，不透明的菌落；革蘭氏染色為陽性。豬場二、三采集樣本分離菌均為1 號菌落形態(tài)的細(xì)菌，樣本中細(xì)菌數(shù)量多而純；從豬場一樣本中分離的細(xì)菌主要為1 號菌落形態(tài)的細(xì)菌，同時還有少量2 號菌落形態(tài)的細(xì)菌。

2.3 分離菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增及測序分析結(jié)果

將分離到的細(xì)菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 并將PCR 產(chǎn)物送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，最后于NCBI 中進(jìn)行Blast 比對分析，結(jié)果，1 號菌落形態(tài)的細(xì)菌為均化膿隱秘桿菌，與GenBank 登錄的化膿隱秘桿菌序列基因同源性為96%以上（見圖6，圖中HN1、HN2、HN3、HN4、HN5、HN7、HN8：本文測出序列 ，HF947290、JN578122、JQ975944、JQ975947：GenBank 登錄的化膿隱秘桿菌16SrRNA 基因序列）；2 號菌落形態(tài)的細(xì)菌為葡萄球菌， 與GenBank登錄的葡萄球菌序列同源性達(dá)到99.9%（見圖7，其中PT1： 本文測出序列，HM484984、HM484985、HM484986、NR036905：GenBank 登 錄 的 葡 萄 球 菌16SrRNA 基因序列）。

圖6 化膿隱秘桿菌與GenBank登錄序列同源性比較結(jié)果

圖7 葡萄菌與GenBank登錄序列同源性比較結(jié)果

4 討論與分析

4.1 病樣采集

本文從湖南省的幾個規(guī)模豬場調(diào)查采樣，從幾頭保育豬的頸部膿包采集了4 個膿汁樣品，從1 頭豬腫大的耳朵采集了1 個膿包樣品，從1 頭保育豬的實(shí)質(zhì)臟器采取了2 個化膿灶樣品。結(jié)果除1 個頸部皮下濃汁樣品同時分離到少量葡萄球菌外，所有樣品均分離到純的、數(shù)量眾多的化膿隱秘桿菌。 所采樣品數(shù)量雖比較少，但膿包產(chǎn)生的部位具有多樣性， 基本上包括了生豬體內(nèi)外常見膿包出現(xiàn)的部位。因此，本文分離細(xì)菌的結(jié)果具有一定的代表性，說明生豬體內(nèi)外常見膿包與化膿隱秘桿菌感染有一定關(guān)聯(lián)，這與國內(nèi)相關(guān)報道具有一致性[2、3]，為生豬體內(nèi)外膿包的防控補(bǔ)充了參考數(shù)據(jù)。

4.2 膿包的成因

化膿隱秘桿菌化膿隱秘桿菌又名化膿放線菌或化膿棒狀桿菌， 為革蘭染色陽性的短棒狀桿菌，普遍存在于牛、羊、豬和其他重要經(jīng)濟(jì)動物的黏膜上，是一種條件性致病菌[2]。該病原最早從牛的膿汁中分離得到，常見于牛、羊、豬的化膿性病灶，表現(xiàn)為肺炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、皮下膿腫等[3]?；撾[秘桿菌已被認(rèn)定為病原菌, 并關(guān)于人感染致病病例也常有報道[5]。

本文從膿汁分離到化膿隱秘桿菌， 分離率為100%。 從本文調(diào)查的生豬頸部皮下膿包的形成原因來看， 其與接種油佐劑疫苗存在一定的關(guān)系，但豬舍不良的衛(wèi)生條件以及較高的氣溫促進(jìn)了膿包的形成， 化膿隱秘桿菌通過注射傷口進(jìn)入生豬體內(nèi)，加上白礦物油難以吸收、易造成組織損傷、無菌性肉芽腫，二因素結(jié)合可能促進(jìn)了細(xì)菌性膿包的形成。 此外，從本文還可見，生豬合群時的打斗，造成生豬體表傷口也是生豬體表形成膿包的重要原因，至于本文采集到的實(shí)質(zhì)臟器發(fā)膿灶樣本可能是由于局部傷口化膿隱秘桿菌感染后，加上生豬免疫力低下，化膿隱秘桿菌在體內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的緣故。

4.3 預(yù)防工作

我國養(yǎng)豬業(yè)集約化養(yǎng)殖模式日益擴(kuò)大，但部分豬場養(yǎng)殖理念未能跟上科學(xué)養(yǎng)豬的要求，飼養(yǎng)管理比較粗放，日常操作消毒意識不強(qiáng)。如：一些豬場對于診療器械的消毒管理極為忽視，針頭、注射器放在窗臺上或裸放在其他地方， 甚至同雜物一同混放，多個病豬用一個針頭等；小豬轉(zhuǎn)群后，豬場管理沒有考慮如何減少混群小豬的打斗程度，造成小豬體表出現(xiàn)多處傷口， 且豬舍環(huán)境差容易出現(xiàn)感染。因此，不少豬場的生豬?？梢姷襟w表或體內(nèi)膿包的出現(xiàn)。 尤其是在氣溫較高，細(xì)菌滋生的夏季更為明顯。 膿包的形成勢必引起生豬生長速度下降，飼料報酬率降低，給養(yǎng)殖戶帶來不必要的損失。 所以筆者認(rèn)為，豬場平常做好各項(xiàng)管理工作，減少和消除各種誘因，對預(yù)防本病有重要意義，特別是加強(qiáng)豬場內(nèi)生豬傷口的預(yù)防、傷口的有效消毒以及改善豬舍內(nèi)的環(huán)境，降低環(huán)境中的病原含量對生豬疾病的防控具有非常重要的意義。

[1]Run Cheng Li,Chao Ting Xiao,Xing Qian,et al.Occurrence of Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in Masked Palm Civet (Paguma larvata)[J].Journal of Animal and Veterinary Advances,2012,11(12):2020-2023.

[2]郭文潔,趙敬翠,劉耀川,等. 化膿隱秘桿菌毒力因子的研究進(jìn)展[J]. 中國獸醫(yī)雜志,2010,46(1)：52-53.

[3]魯杏華,何世成,談志祥,等.豬化膿隱秘桿菌的分離與鑒定[J].中國畜牧獸醫(yī),2009,36（5):3.

[4]Plamondon M,Martinez G,Raynal L,et al.A fatal case of A rcanobacterium pyogenes endocarditis in a man with no identified animal contact:case report and review of the literature .Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2007,26(9):663-666.

[5]Takemi O,Tomoyuki S,Hideki K,et al.Hemo rrhagic necrotizing splenitis in a slaughter pig infected with Arcanobacterium species .Journal Veterinary Medicine Science,2007,69(4):449-453 .