許春燕，劉希望，楊亞軍，郭沂濤，李劍勇

（農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州730050）

中獸藥具有多靶點(diǎn)及病原微生物對其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，在抗菌抗病毒的同時(shí)，還能促進(jìn)動物生長、提高機(jī)體抗病力，其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用廣泛，取得了良好效果［1］。研究表明，中藥復(fù)方在防控禽類傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）方面有顯著的臨床效果［2］。口服液是在湯劑、散劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新劑型，具有劑量小、吸收較快、質(zhì)量穩(wěn)定、攜帶和服用方便、易于保存等優(yōu)點(diǎn)，在制劑中占有比例逐年上升［3］。

銀翹藍(lán)芩口服液由金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃芩等中藥組成，是從中獸醫(yī)整體觀出發(fā)，辨證加減并通過臨床療效試驗(yàn)篩選后研制成的新型中獸藥產(chǎn)品。該口服液以傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論為基礎(chǔ)，運(yùn)用現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)，經(jīng)過將金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃芩等中藥材與水共煎煮醇沉等工藝，富集其有效成分制備而成。藥效學(xué)表明，銀翹藍(lán)芩口服液清熱解毒、解表平喘，具有抑菌、免疫促進(jìn)等藥學(xué)作用［4－5］。金銀花具有清熱解毒、抗病原微生物、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等作用，且對常見的呼吸道病毒有較強(qiáng)的抑制作用［6］，綠原酸是其主要有效成分，藥理活性顯著，常作為金銀花薄層色譜鑒別指標(biāo)［7］。連翹有辛涼清熱、芳香辟邪的功效，被認(rèn)為是中藥中的抗生素，其主要生物活性成分連翹苷具有較強(qiáng)抗菌作用，常作為連翹薄層鑒別指標(biāo)［8－9］。黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎之效，其有效成分黃芩苷對多種病毒有抑制作用，常選取黃芩苷作為黃芩薄層鑒別指標(biāo)［10－13］?？鄥⑽犊?，性寒，具有清熱燥濕，殺蟲利尿的功效，苦參堿及氧化苦參堿是其主要藥理活性成分，也是其薄層鑒別的常用指標(biāo)［14］。

薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）具有操作方便、設(shè)備簡單、分離效率高、專屬性好、分析快、色譜參數(shù)易調(diào)整等特點(diǎn)，在藥物分析中，特別是復(fù)方制劑中應(yīng)用廣泛［15－16］。為了更好的控制該復(fù)方口服液的產(chǎn)品質(zhì)量，本研究采用TLC法對該復(fù)方口服液中的金銀花、連翹、黃芩及苦參進(jìn)行了定性鑒別，為口服液質(zhì)量控制提供理論依據(jù)［17］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品 供試品銀翹藍(lán)芩口服液，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所獸藥研究室自制；金銀花對照藥材（批號121060－201107）、綠原酸對照品（批號110753－200413）、連翹對照藥材（批號120908－201216）、連翹苷對照品（批號110821－201112）、黃芩對照藥材（批號120955－201008）、黃芩苷對照品（批號110715－201117）、苦 參 對 照 藥 材（批 號121019－200106）、苦參堿（批號110805－200508）、氧化苦參堿對照品（批號110780－200506），購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 板（10cm×10cm），青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；聚酰胺薄膜（10cm×10cm），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純；水為去離子水。

1.1.2 儀器設(shè)備 ME235S賽多利斯微量天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；DRT－SX 電子調(diào)溫電熱套，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；R－215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI SWITZERLAND。

1.2 方法

1.2.1 金銀花薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液1mL，加甲醇1mL，制成供試品溶液。取金銀花粉末0.2g，加甲醇5mL，超聲30min，濾過，濾液作為對照藥材溶液。取綠原酸對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取金銀花外的其他中藥材，制得缺金銀花陰性口服液，按照供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。吸取上述4 種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一以0.04 g／mL醋酸鈉水溶液浸泡過的硅膠G 薄層板上，以乙酸丁酯－甲酸－水（7∶2.5∶2.5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.01g／mL 亞硝酸鈉甲醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.2 連翹薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液20mL，通過D101型大孔吸附樹脂（內(nèi)徑為2cm，柱高為10cm），用100mL 超純水洗脫，棄去洗液，再用乙醇－水（30∶70）溶液120mL洗脫，棄去洗液，最后用乙醇－水（50∶50）溶液120mL 洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取連翹對照藥材0.5g，加甲醇10mL，超聲處理20min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解。取連翹苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取連翹外的其他中藥材，制得缺連翹陰性口服液，按照供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。吸取對照品溶液2μL，其余3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.1mL／mL硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.3 黃芩薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液5mL，加水15mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1，用乙酸乙酯提取2次，每次20mL，合并兩次乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL 使溶解，作為供試品溶液。取黃芩對照藥材0.5g，加乙酸乙酯－甲醇（3∶1）的混合溶液30mL，加熱回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL 使溶解，作為對照藥材溶液。取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取黃芩外的其他中藥材，制得缺黃芩陰性口服液，按照供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。吸取上述4種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄薄膜上，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（10∶6∶3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.02g／mL 三氯化鐵水溶液。供試品色譜中，應(yīng)在與對照品及對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

1.2.4 苦參薄層鑒別 取供試品銀翹藍(lán)芩口服液5mL，加水5mL，加濃氨試液1mL，混勻，用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL 使溶解，作為供試品溶液。取苦參對照藥材粗粉0.5g，加三氯甲烷10 mL，濃氨試液0.2mL，超聲處理15min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄?.5mL 使溶解，作為對照藥材溶液。取苦參堿對照品和氧化苦參堿對照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按處方取苦參外的其他中藥材，制得缺苦參陰性口服液，照供試品溶液制備方法，制成陰性對照溶液。吸取上述4種溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－濃氨試液（8∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 金銀花薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，在與綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的土褐色斑點(diǎn)；在與金銀花對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色3個(gè)斑點(diǎn)；陰性對照品在相同位置無相應(yīng)斑點(diǎn)，即該方法陰性對照無干擾，方法具有專一性（圖1）。

圖1 銀翹藍(lán)芩口服液中金銀花TLC圖Fig.1 TLC of Lonicera japonicain Yinqiao lanqin oral liquid

2.2 連翹薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，在與連翹苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的紅褐色斑點(diǎn)；在與連翹對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)；連翹陰性對照在相同位置無相應(yīng)斑點(diǎn)，即陰性對照無干擾，方法具有專一性（圖2）。

圖2 銀翹藍(lán)芩口服液中連翹TLC圖Fig.2 TLC of Forsythia suspensain Yinqiao lanqin oral liquid

2.3 黃芩薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，與黃芩苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的墨綠色斑點(diǎn)；與黃芩對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照在相同位置無相應(yīng)斑點(diǎn)，即陰性對照無干擾，方法具有專一性（圖3）。

圖3 銀翹藍(lán)芩口服液中黃芩TLC圖Fig.3 TLC of Scutellaria baicalensis in Yinqiao lanqin oral liquid

2.4 苦參薄層鑒別

3批供試品銀翹藍(lán)芩口服液的薄層色譜中，在與苦參堿和氧化苦參堿對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同橘紅色斑點(diǎn)；在與苦參對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同橘紅色斑點(diǎn)；苦參陰性對照在相同位置無相應(yīng)斑點(diǎn)，即陰性對照無干擾，方法具有專一性（圖4）。

3 討論

圖4 銀翹藍(lán)芩口服液中苦參TLC圖Fig.4 TLC of Sophora flavescens in Yinqiao lanqin oral liquid

根據(jù)《中國獸藥典》中各味藥材及其他復(fù)方制劑中相應(yīng)中藥材的薄層色譜鑒別方法，通過試驗(yàn)，確定了金銀花、連翹、黃芩及苦參的定性鑒別方法。在金銀花的鑒別中，起初參照《中國獸藥典》2010年版二部金銀花藥材薄層鑒別方法試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法分離度較差，且斑點(diǎn)不清晰。后參照《中國藥典》2010年版一部小兒感冒寧糖漿質(zhì)量控制研究中金銀花的鑒別方法，展開劑合適，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，方法專一。在連翹的鑒別中，起初參照《中國獸藥典》2010年版二部中連翹藥材薄層鑒別方法試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連翹苷由于含量較低，薄層鑒別的斑點(diǎn)不明顯。因此，嘗試了用乙酸乙酯提取、濃縮，提高連翹苷含量的方法，效果仍不明顯。原因可能是連翹苷屬于大極性化合物，在水中溶解度較高，乙酸乙酯萃取并不能有效富集連翹苷。最終參考《中國藥典》2010年版一部清熱解毒口服液中連翹的鑒別定方法，采用大孔吸附樹脂富集連翹苷并除去其他雜質(zhì)，結(jié)果顯示斑點(diǎn)清晰，方法專一。在黃芩的鑒別中，起初參照《中國獸藥典》2010 年版二部黃芩藥材的薄層鑒別方法試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離度較差，且其他成分干擾較嚴(yán)重。最后參照《中國藥典》2010 年版一部小兒感冒顆粒質(zhì)量控制研究中黃芩的鑒別方法，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，方法專一。在苦參的鑒別中，參照《中國獸藥典》2010 年版二部藥材苦參的薄層鑒別方法試驗(yàn)，對口服液樣品及陰性對照品采用加適量氨水游離出苦參堿和氧化苦參堿，再用三氯甲烷提取濃縮的辦法進(jìn)行富集、除雜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法分離度好，斑點(diǎn)清晰，方法專一。

本中獸藥復(fù)方口服液為清熱解毒、解表平喘的新獸藥產(chǎn)品，為了該復(fù)方口服液的推廣使用，需建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以保證復(fù)方口服液的質(zhì)量。本研究采用的TLC法可以對該復(fù)方口服液的主要藥材進(jìn)行薄層色譜鑒別，且方法簡便、專屬性強(qiáng)，因此可以達(dá)到控制銀翹藍(lán)芩口服液質(zhì)量的目的。

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