王開(kāi)誠(chéng)

湖南省婁底市第一中學(xué)

轉(zhuǎn)Bt+Epsps基因稻谷對(duì)小鼠腸道菌群多樣性的影響

王開(kāi)誠(chéng)

湖南省婁底市第一中學(xué)

本研究以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以傳代實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，在飼喂不同含量的轉(zhuǎn)Bt＋Epsps基因稻谷和等量同品種常規(guī)稻谷后取小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)親、子代各組小鼠腸道微生物DNA在電泳條帶上略有差異，但未達(dá)顯著性水平；菌落數(shù)和電泳條帶的相似度大，差異不顯著。

雙價(jià)抗蟲(chóng)抗除草劑基因（Bt+Epsps）；DGGE;相似性指數(shù)

一實(shí)驗(yàn)方法

1.腸道微生物樣品采集

隨機(jī)抽取30日齡小鼠5只以摘除眼球放血致死，用70%的酒精將其體表消毒、在無(wú)菌條件下解剖。將同一組5只鼠剩余的回腸和盲腸腸腔內(nèi)容物均勻混合，取1g迅速注入對(duì)應(yīng)無(wú)菌離心管中，于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.培養(yǎng)

根據(jù)腸道常見(jiàn)微生物的不同營(yíng)養(yǎng)需求，配制選擇培養(yǎng)基，樣品涂布到擇培養(yǎng)基上后置于恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，長(zhǎng)出菌落后，選擇平皿中菌落數(shù)量在30-300間的菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出每克原始樣品中所含菌落總數(shù)。

3.樣品前處理

樣品經(jīng)室溫解凍樣品后，各取1g左右腸道內(nèi)容物用1.5m l磷酸鹽緩沖溶液，懸浮沉淀，反復(fù)離心，直到上清液澄清為止。最后以1.0m lPBS懸浮所收沉淀，置于EP管中-70℃保存。

4.DNA的提取

將上述樣品以12000r/min的速度離心5min，除去上清液，按照DNA提取試劑盒操作步驟提取，提取物在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5.DNA的定量和純度檢測(cè)

用DNA定量?jī)x測(cè)定DNA含量，以O(shè)D260/OD280值評(píng)價(jià)DNA的純度，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段大小。

6.PCR擴(kuò)增

用細(xì)菌通用引物對(duì)細(xì)菌16SrDNA的V3區(qū)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增所用引物由上海生物工程有限公司合成。經(jīng)35次循環(huán)后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

7.變性梯度凝膠電泳

將PCR產(chǎn)物用變性梯度凝膠電泳儀于8%的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，用AgNO3染色，顯色定影后用凝膠成像掃描系統(tǒng)照相。

8.主要優(yōu)勢(shì)菌群的鑒別

用一次性手術(shù)刀從DGGE膠中切去目的條帶、離心管、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)后，回收、純化目的片段，送撿、測(cè)序。

二、結(jié)果與分析

1.實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

將被檢樣品計(jì)數(shù)菌落數(shù)、單因素方差分析。可知：親子代各組腸道微生物除乳桿菌差異顯著（P＜0.05）,其余各指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。

2.DGGE條帶分析

各樣品經(jīng)DGGE分離顯示出了數(shù)目不等的電泳條帶(見(jiàn)圖1)，每個(gè)條帶至少代表一個(gè)菌種，條帶的粗細(xì)代表微生物的濃度，條帶越粗（如條帶4、7等）表明該微生物菌群含量越高，反之越低。由圖3可知，條帶在強(qiáng)度和遷移率方面存在一定的差異，不同組之間既有共同條帶（如條帶1、4、7、8、10等），也有特異條帶（如條帶2、3等）。條帶2、3在親代1、2、3、4組表現(xiàn)明顯，在陰性組和子代表現(xiàn)不明顯，可能與小鼠食用稻谷后，對(duì)小鼠腸道環(huán)境有一定影響，有利于某些微生物生長(zhǎng)，隨著食用代數(shù)增加，小鼠逐漸適應(yīng)口糧，這些微生物數(shù)量減少。而4號(hào)條帶在陰性組和子代各組表現(xiàn)明顯，可能與小鼠食用稻谷后，對(duì)小鼠腸道環(huán)境有一定影響，不利于某些微生物的生存，隨著食用代數(shù)增加，小鼠逐漸適應(yīng)口糧，腸道環(huán)境

逐漸改善，這些微生物數(shù)量恢復(fù)正常。

1234 51’2’3 4’5’

圖1 小鼠腸道微生物DGGE電泳條帶分布情況。親代1-5組，子一代1’-5’組。

3.相似性分析

親代和F1代各組小鼠腸道微生物菌群相似性系數(shù)(CS)如表1。親代和F1代1組、3組和5組之間，2組、4組和5組之間小鼠腸道微生物菌群相似性系數(shù)為77%～81%，相似程度大，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 小鼠腸道微生物主要菌群相似性系數(shù)/%（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）

4.主要優(yōu)勢(shì)菌群

將如圖1所示的1～10號(hào)條帶的16SrDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示小鼠腸道微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌群有：1—加氏乳酸桿菌；2，3，9—非培養(yǎng)的未知細(xì)菌；4—約氏乳酸桿菌；5—緩慢葡萄球菌；6—科氏葡萄球菌；7—腸乳桿菌；8—鼠乳桿菌；10—施氏葡萄球菌。

三、小結(jié)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌數(shù)量在各組間差異顯著，這與DGGE電泳條帶上4號(hào)條帶在親代40%轉(zhuǎn)、40%常、60%轉(zhuǎn)、60%常不明顯、而陰性和子代各組條帶特別明顯是一致的。說(shuō)明飼料中的稻谷對(duì)腸道環(huán)境有一定影響，但這一影響不一定是轉(zhuǎn)基因造成的。腸道微生物基因組DNA在DGGE圖譜中，條帶數(shù)和位置較復(fù)雜，體現(xiàn)了小鼠腸道微生物的多樣性。實(shí)驗(yàn)確定的小鼠腸道微生物的主要優(yōu)勢(shì)菌群，屬于厭氧菌的有乳酸桿菌，屬于需氧菌的有葡萄球菌、腸乳桿菌、鼠乳桿菌。這些優(yōu)勢(shì)菌群是哺乳動(dòng)物腸道正常的細(xì)菌，與祝小楓等的研究結(jié)果一致。

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