張智 朱廣志 彭濤 趙國良 徐靜

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

基礎(chǔ)研究

慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)組織蛋白酶S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的作用

張智 朱廣志 彭濤 趙國良 徐靜

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

目的 建立慢病毒介導(dǎo)過表達(dá)組織蛋白酶S（cathepsin S，Cat S）基因的肝癌細(xì)胞株，觀察Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法 利用Age I和EcoR I雙酶切獲得目的基因片段，構(gòu)建靶向過表達(dá)Cat S基因的慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro，通過人胚腎上皮293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒制備并感染肝癌MHCC97H細(xì)胞。使用嘌呤霉素加壓篩選，建立穩(wěn)定過表達(dá)Cat S基因的肝癌細(xì)胞株。通過RT-PCR、Western blot、MTT、Transwell和劃痕實驗研究穩(wěn)定過表達(dá)Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果 成功包裝靶向過表達(dá)Cat S基因慢病毒載體并感染肝癌MHCC97H細(xì)胞。慢病毒感染后，與空載對照細(xì)胞Mock-MHCC97H相比，慢病毒CatS-MHCC97H細(xì)胞CatSmRNA、CatS蛋白及MMP-2蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.05），細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力亦明顯增強（P<0.05）。結(jié)論 慢病毒介導(dǎo)的CatS基因過表達(dá)可能通過上調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌MHCC97H細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，Cat S基因可能是治療肝癌的一個潛在靶點，這為闡明肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機制及提高肝癌基因治療提供了新的實驗依據(jù)。

肝腫瘤；組織蛋白酶S；過表達(dá)；慢病毒；增殖；遷移

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱“肝癌”）是世界范圍內(nèi)第五位常見癌癥［1］，據(jù)統(tǒng)計全世界每年新增病例超過660 000例［2，3］。診斷技術(shù)的發(fā)展使肝癌能獲得早期診斷和治療［4，5］，但即使早期小肝癌手術(shù)切除后，5年轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率仍然超過50%［6］。因此，尋找與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感靶蛋白對研究肝癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機制具有重要意義。組織蛋白酶S（cathepsin S，Cat S）基因是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族（Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X）成員之一。研究表明Cat S基因在肺癌、前列腺癌、胃癌和星形細(xì)胞瘤等多種腫瘤中過表達(dá)［7～10］，而沉默Cat S基因可抑制腺腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞的侵襲和血管生成，提示其在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用［11］。我們的前期研究結(jié)果表明，Cat S基因在肝癌組織中呈高表達(dá)并和門靜脈癌栓及腫瘤肝外轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［12］。然而，過表達(dá)Cat S基因在肝癌細(xì)胞的生長和侵襲中的作用尚未清楚。為此，本研究通過慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定過表達(dá)Cat S基因，觀察其對肝癌MHCC97H細(xì)胞生長和增殖的影響，以期闡明Cat S基因在體外對肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機制，為肝癌治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 肝癌MHCC97H細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，該細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒載體pLVXEGFP-3FLAG-Puro，不攜帶紅色熒光的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記。大腸桿菌DH5α和人胚腎上皮293T細(xì)胞株由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院中醫(yī)科實驗室保存。肝癌MHCC97H細(xì)胞和293T細(xì)胞均培養(yǎng)于10%FBS的DMEM中，細(xì)胞培養(yǎng)條件為恒溫37°C、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.1.2 試劑和儀器 Age I和EcoR I購于美國NEB公司，慢病毒表達(dá)包裝試劑盒（Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit）購自美國Invitrogene公司，無內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購自美國Promega公司，Trizol購自美國Invitrogene公司，RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物合成購自上海捷瑞生物工程有限公司，MTT購自美國Sigma公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自美國Omega公司，六孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和Transwell小室購自美國Corning公司，Anti-Cat S抗體和 Anti-rabbit HRG酶標(biāo) IgG抗體購于美國 Santa Cruz公司，Anti-βactin抗體購于美國 Sigma公司，Western blot一抗稀釋液和RIPA裂解液購于碧云天生物技術(shù)研究所，ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro構(gòu)建及鑒定 使用EcoR和Xba I對pLVX-EGFP-3FLAGPuro表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，切去EGFP-3FLAG片段（810 bp），酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收約8.1 kb的載體片段。對目的基因進(jìn)行擴增。引物設(shè)計合成：上游引物為5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3，下游引物為5′-CAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGC-3′。利用EcoR I和Xba I對化學(xué)合成的目的基因進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收約1 kb的目的基因片段。將目的基因連接入表達(dá)載體，將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μl含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，恒溫37°C振搖過夜，從中取1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。接種陽性克隆，取100μl送測序，測序結(jié)果完全正確后再接種進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.2.2 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro及空載對照質(zhì)粒pSB53-L.V的制備 取對數(shù)生長期的人胚腎上皮293T細(xì)胞常規(guī)消化重懸成單個細(xì)胞，提前1 d按照2×105個細(xì)胞/孔接種到6孔板中。按慢病毒包裝試劑盒說明書對過表達(dá)質(zhì)粒pLVX-EGFP-3FLAGPuro和空載對照質(zhì)粒pSB53-L.V進(jìn)行包裝，常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集上清液，置于4°C、1 200 r/min離心10min，過濾后，置于4°C、1 500 r/min離心4 h進(jìn)行濃縮。藥篩法測定慢病毒的滴度。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌MHCC97H細(xì)胞 實驗前1 d將對數(shù)生長期的肝癌MHCC97H細(xì)胞按照5×104個細(xì)胞/孔鋪在24孔板中，分別加入慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro和空載對照質(zhì)粒pSB53-L.V病毒液和終質(zhì)量濃度為5μg/ml的聚凝胺。培養(yǎng)24 h后更換新鮮的10%FBSDMEM，傳代擴大培養(yǎng)。21 d后拍攝熒光照片，不攜帶紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞命名為慢病毒Cat S-MHCC97H細(xì)胞組，攜帶少數(shù)紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞命名為空載對照Mock-MHCC97H細(xì)胞組。

1.2.4 RT-PCR法檢測Cat SmRNA的表達(dá)情況 按invitrogene Trizol說明書提取 pLVX-EGFP-3FLAGPuro組和空載對照pSB53-L.V組細(xì)胞總 RNA，以cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測。PCR引物：Cat S上游引物為5′-GCCTGATTCTGTGGACTGG-3′，下游引物為5′-GATGTACTGGAAAGCCGTTGT-3′；GAPDH上游引物為5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′，下游引物為5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′。qRT-PCR循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃15 s，每一步變性95℃5 s，退火延伸60℃30 s，共45個循環(huán)。每組重復(fù)實驗3次，取其平均值，數(shù)據(jù)分析采用RT-PCR儀的Opticon-MonitorTMAnalysis軟件完成。

1.2.5 Western blot法檢測Cat S蛋白和MMP-2蛋白的表達(dá)情況 取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的Cat SMHCC97H細(xì)胞和對照Mock-MHCC97H細(xì)胞，按照4×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，24 h后離心收集細(xì)胞、裂解，4°C、12 000 r/min離心10min，去沉淀收集上清液。BCA試劑盒測定細(xì)胞總蛋白濃度，制作蛋白樣品。利用10%分離膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA室溫下封閉1 h，然后分別加入Anti-Cat S抗體（1∶1 000）、Anti-MMP-2抗體（1∶1 000）和Anti-βactin抗體（1∶10 000），4°C過夜。用1×TBST洗膜3×10min后分別加入鼠二抗或者兔二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h，1×TBST洗膜3×10min后加入適量發(fā)光液，ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)記錄蛋白條帶結(jié)果。

1.2.6 MTT實驗觀察CatS基因過表達(dá)對肝癌MHCC97H細(xì)胞生長的影響 分別消化Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后取1×103個細(xì)胞/孔接種到96孔板中，各接種8塊板。每隔24 h隨機取1塊板，每孔加入10μlMTT溶液（10mg/ml），常規(guī)培養(yǎng)4 h后，每孔加入150μl的DMSO，振蕩5 min，置于多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.7 劃痕實驗觀察 Cat S基因過表達(dá)對肝癌MHCC97H細(xì)胞遷移的影響 取生長良好的Cat SMHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞，分別以5×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板，細(xì)胞長至飽和狀態(tài)后，用無菌Tip頭劃出無細(xì)胞痕，然后加入含有8μg/ml的絲裂霉素C、無血清的DMEM培養(yǎng)基1 m l。常規(guī)培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察相同位置細(xì)胞的遷移情況。1.2.8 Transwell小室趨化實驗觀察Cat S基因過表達(dá)對肝癌MHCC97H細(xì)胞遷移的影響 取生長良好的Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞，分別以2×104個細(xì)胞/孔接種于Transwell小室的上室，加入無血清的DMEM培養(yǎng)，下室加入500μl 20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，甲醇固定5 min，結(jié)晶紫染色5 min，小室在倒置顯微鏡下隨機選擇中央及四周8個視野（×100），計數(shù)每個視野穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)目。重復(fù)實驗3次，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，兩兩比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro酶切鑒定

慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro用EcoR和Xba I進(jìn)行雙酶切，切去EGFP-3FLAG片段（810 bp），酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后回收約8.1 kb的載體片段，與預(yù)計結(jié)果符合，證明載體構(gòu)建成功。見圖1。

2.2 雙酶切獲得目的基因片段

化學(xué)合成的Cat S目的基因用EcoR I和Xba I對進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后回收約1 kb的目的基因片段。與預(yù)計結(jié)果符合，證明目的基因合成正確。酶切圖譜見圖2。

2.3 陽性克隆鑒定

挑取平板上長出的轉(zhuǎn)化子，重懸于10μl LB培養(yǎng)液中，再從中取出1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性克隆得到1 256 bp的片斷，陰性克隆得到1 058 bp的片斷。菌落PCR鑒定見圖3。接種陽性克隆，取其中100μl送測序。陽性克隆測序結(jié)果和預(yù)期的序列完全一致。

圖1 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro的鑒定

圖2 酶切獲得目的基因片段

圖3 陽性菌落PCR鑒定圖

2.4 慢病毒感染肝癌MHCC97H細(xì)胞

藥篩法測定慢病毒滴度為2×108（TU/ml），將慢病毒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro和空載對照質(zhì)粒pSB53-L.V感染肝癌MHCC97H細(xì)胞21 d后拍攝熒光照片。Cat S-MHCC97H細(xì)胞不攜帶紅色熒光標(biāo)記，空載對照Mock-MHCC97H細(xì)胞攜帶少量的熒光。見圖4。

2.5 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat SmRNA的表達(dá)

慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌MHCC97H細(xì)胞后，RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Cat S-MHCC97H細(xì)胞中Cat SmRNA的表達(dá)量明顯高于Mock-MHCC97H細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖4 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染21d后的肝癌MHCC97H細(xì)胞（×200）

圖5 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat Sm RNA的相對表達(dá)量

2.6 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat S蛋白的表達(dá)

慢病毒感染后，Western blot檢測結(jié)果顯示，Cat SMHCC97H細(xì)胞CatS蛋白的表達(dá)量較Mock-MHCC97H細(xì)胞增加，約為Mock-MHCC97H細(xì)胞的2倍。此外，Cat S-MHCC97H細(xì)胞中MMP-蛋白的表達(dá)量也明顯高于Mock-MHCC97H細(xì)胞。見圖6。

圖6 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat S蛋白和MMP-2蛋白的表達(dá)

2.7 Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，第4天Cat S-MHCC97H細(xì)胞的生長速度較Mock-MHCC97H細(xì)胞明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示過表達(dá)Cat S基因可增強肝癌MHCC97H細(xì)胞的生長活性。見圖7。

圖7 過表達(dá)Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖能力的影響

2.8 CatS基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞遷移能力的影響

常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行劃痕實驗，結(jié)果顯示，Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞的遷移率分別為（22±1.1）%和（18±1.4）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示Cat S基因過表達(dá)后能明顯促進(jìn)Cat S-MHCC97H細(xì)胞遷移。見圖8。

2.9 Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室趨化實驗結(jié)果顯示，Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（87±5.9）個和（32±4.6）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示過表達(dá)Cat S基因后肝癌MHCC97H細(xì)胞的運動侵襲能力增強。見圖9。

圖8 過表達(dá)CatS基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

圖9 過表達(dá)CatS基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

3 討論

組織蛋白酶屬于同源性蛋白酶，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)［13］。Cat S基因作為組織蛋白酶家族（Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X）的成員之一，通常位于溶酶體內(nèi)，被激活后分泌到細(xì)胞表面，然后進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［14，15］。Flannery等［7］用免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)，Cat S基因在人星形細(xì)胞瘤中高表達(dá)，而且與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)，在Ⅳ期腫瘤中表達(dá)量最高，但在正常星形細(xì)胞中未見表達(dá)。許多研究亦證實Cat S基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡［16］，誘導(dǎo)內(nèi)皮生長因子釋放，促進(jìn)新生血管生成等［15］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。然而，Cat S基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機制尚未清楚。慢病毒載體由于可穩(wěn)定地將目的基因整合到宿主基因組中，并長期地表達(dá)該目的基因而被用于基因治療。隨著相關(guān)技術(shù)不斷發(fā)展、進(jìn)步，目前應(yīng)用慢病毒技術(shù)不僅可上調(diào)基因表達(dá)，還可從基因組水平研究基因功能。為此，本研究利用慢病毒載體作基礎(chǔ)，將Cat S基因的編碼區(qū)域克隆于慢病毒載體，成功建立了過表達(dá)Cat S基因肝癌細(xì)胞，為后續(xù)研究Cat S基因功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

肝癌是世界范圍內(nèi)死亡率較高的常見惡性腫瘤，但目前對其尚無有效的治療措施，主要是因為各種療法均未能很好地解決腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題，進(jìn)而極大影響了其臨床療效。隨著人們對肝癌機制的研究不斷深入以及分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，肝癌的基因治療成為繼手術(shù)、放化療及介入治療之后的一種新型治療方法，因此，尋找肝癌治療有效的靶點，尤其是與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感靶基因?qū)μ岣吒伟┡R床療效至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌MHCC97H細(xì)胞過表達(dá)Cat S基因后，明顯促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖和侵襲，與我們前期的研究結(jié)論一致。提示Cat S基因可能在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是治療肝癌的一個潛在靶點。

最近研究表明蛋白質(zhì)組學(xué)對腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點的選擇具有重要作用［17］。Palermo等［18］認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs），包括基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）是腫瘤研究領(lǐng)域的重點內(nèi)容之一。MMPs主要通過降解的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）促進(jìn)腫瘤侵襲［19］。MMP-2可以降解腫瘤血管的基底膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、遷移，與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移亦密切相關(guān)［20，21］。進(jìn)一步研究顯示，組織蛋白酶通過降解ECM促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成［22］。有報道稱Cat S參與了降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白［15，23］及MMP-2［24］。本研究觀察了肝癌MHCC97H細(xì)胞過表達(dá)Cat S基因后MMP-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Cat S基因能顯著增加肝癌MHCC97H細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)，推測Cat S基因過表達(dá)可使肝癌細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)量升高，從而促進(jìn)肝癌MHCC97H細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，有關(guān)方面有待進(jìn)一步深入研究。

隨著對肝癌自然病程與生物學(xué)特性的認(rèn)識不斷深入以及目前臨床上各種治療方法的優(yōu)化和聯(lián)合應(yīng)用，肝癌的治療理念和策略將發(fā)生深刻轉(zhuǎn)變，而分子靶向治療異常改變的基因，將在肝癌臨床治療中具有良好的發(fā)展前景。本研究認(rèn)為過表達(dá)Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和侵襲具有促進(jìn)作用，其分子生物學(xué)機制可能與MMP-2蛋白的表達(dá)有關(guān)，提示CatS基因可能成為治療肝癌的一個潛在靶點，這為促進(jìn)肝癌基因治療及進(jìn)一步闡明肝癌增殖和轉(zhuǎn)移機制提供新的思路。

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［2015-03-23收稿］［2015-05-25修回］［編輯 羅惠予］

Effects of lentivirus-mediated overexpression of Cat S gene on proliferation and m igration of hepatocellular carcinoma cellMHCC97H

ZHANG Zhi，ZHU Guangzhi，PENG Tao，ZHAO Guoliang，XU Jing（Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

XU Jing.E-mail：jxuapr@aliyun.com

Objective To construct a lentivirus expression vector to drive stable Cat S overexpression in the hepatocellular carcinoma（HCC）cell line MHCC97H，and to investigate the effects of overexpression on cell proliferation and migration.M ethods The Cat S gene was inserted into the lentiviral expression vector pLVX-EGFP-3FLAG-Puro using Age I and EcoR I restriction enzymes and transfected into 293T cells to generate recombinant lentivirus.This virus was used to infect MHCC97H cells，and positive cells were selected using puromycin.Real-time quantitative PCR，Western blots，MTT assay，the transwellmigration assay and the wound healing migration assay were used to assess the effects of Cat S overexpression on proliferation and migration of MHCC97H cells.Results A lentiviral vector containing the Cat S gene was constructed，and an MHCC97H cell line stably overexpressing Cat Swas established. Cat Soverexpression was associated with significantly shorter cell doubling time，aswell as significantly greater invasion and migration abilities.Conclusions Lentivirus-mediated Cat Soverexpression can increase MHCC97H proliferationand migration，opening the doorto future studies ofmolecularmechanisms of liver cancer invasion and metastasis.

Liver neoplasm；Cathepsin S；Overexpression；Lentivirus infections；Proliferation；Migration

R735.7

A

1674-5671（2015）04-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.02

國家自然科學(xué)基金資助項目（81360372）；廣西自然科學(xué)基金資助項目（2011GXNSFA018284）；廣西衛(wèi)生廳科研基金資助項目（GZKZ10-114）

徐靜。E-mail：jxuapr@aliyun.com