覃思繁 韋常宏 羅元 林思彤 黃俊淇 陶展飛

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科

技術(shù)與方法

全自動免疫組化染色平臺在臨床病理檢查中的應(yīng)用

覃思繁 韋常宏 羅元 林思彤 黃俊淇 陶展飛

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科

目的 探討全自動免疫組化染色儀在臨床病理檢查中的應(yīng)用價值。方法 用統(tǒng)一的二抗，同一種一抗對臨床常用于檢測乳腺癌的ER、PR、HER-2、Ki-67、p53等5種免疫組化抗體，分別采用全自動免疫組化儀（實驗組）和手工操作法（對照組）進行免疫組化染色，對比兩組檢測的結(jié)果。結(jié)果 實驗組和對照組ER、PR、HER-2、Ki-67、p53等5種免疫組化抗體在邊緣效應(yīng)、特異性、著色情況、背景等均有差異。全自動免疫組化染色儀染色結(jié)果均勻，陽性定位準(zhǔn)確，背景較清晰，無邊緣效應(yīng)，檢測結(jié)果理想，優(yōu)于手工操作法。結(jié)論 全自動免疫組化染色儀工作比較穩(wěn)定，染色效果優(yōu)良，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，能減少手工操作的誤差，易于質(zhì)量控制，可為臨床診斷和治療提供更加準(zhǔn)確和科學(xué)的實驗依據(jù)。

全自動免疫組化染色儀；免疫組化；手工操作法；標(biāo)準(zhǔn)化；質(zhì)量控制；應(yīng)用

在我國，乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位［1］，隨著乳腺癌綜合診治水平的提高，對臨床病理診斷的質(zhì)量要求亦越來越高，乳腺癌常用的檢測指標(biāo)ER、PR、HER-2、Ki-67、p53對指導(dǎo)乳腺癌的治療至關(guān)重要［2］。優(yōu)良的免疫組化檢測結(jié)果是正確病理診斷的前提和基礎(chǔ)，因而受到普遍重視。由于免疫組化是一種較強的技術(shù)性操作，每一步實驗操作都有可能影響最后的檢測結(jié)果［3］。同時，外界因素也可以影響實驗結(jié)果，如天氣狀況、時間、環(huán)境溫度、個人操作方法等，所以免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制一直是病理技術(shù)關(guān)注的問題。全自動免疫組化染色儀的問世，使免疫組化實現(xiàn)了相對標(biāo)準(zhǔn)化［4］。本實驗采用全自動免疫組化染色儀染色（簡稱全自動法）與手工操作染色法（簡稱手工操作法）對乳腺癌ER、PR、HER-2、Ki-67、p53 5種抗體進行免疫組化染色，比較兩種染色方法的檢測結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

美國羅氏公司BenchMark XT全自動免疫組化檢測主機（包括試劑模塊、染色模版及廢液收集模塊），與之配套使用的聯(lián)想計算機及專業(yè)操作軟件（VENTANA）、激光條碼標(biāo)簽打印機、不間斷電源儀等。

1.2 材料

用APES與丙酮按1∶50混合配制處理過的防脫載玻片，常規(guī)制備待檢乳腺癌組織切片，隨機選取我科2012年2～4月的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本3例。按一定比例配制牛奶液、洗潔精等。

1.3 試劑

選用福州邁新公司的即用型一抗ER、PR、HER-2、Ki-67、p53，系統(tǒng)配套使用的試劑盒（主要包括二抗、DAB顯色液、蘇木素復(fù)染液等），不含有機溶劑的脫蠟液、封蓋清洗緩沖液、氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液、CC1細(xì)胞預(yù)處理液、CC2細(xì)胞預(yù)處理液、選擇液等。

1.4 實驗方法

選擇3例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本蠟塊，實驗分為全自動免疫組化儀染色（實驗組）和手工操作染色（對照組）。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌3例，每例選取一個蠟塊，每一蠟塊同時用兩種方法檢測ER、PR、HER-2、Ki-67、p53 5種抗體，即一個蠟塊常規(guī)連續(xù)切取10張白片（4μm），并將切片浸于預(yù)先經(jīng)過2%APES丙酮處理過的防脫玻片上，65℃烤片1 h左右，其中5張白片用于實驗組（一張白片做一個抗體），另外5張白片用于對照組。兩組實驗均設(shè)陽性對照和陰性對照。⑴對照組采用Elivison兩步法進行染色。⑵實驗組采用配套的操作程序（VENTANA）完成染色，具體步驟：①首先將檢測用的5種免疫組化試劑的標(biāo)簽打印好并貼在試劑瓶上，然后進行編程，主要包括烤片、脫蠟、一抗和二抗的時間、溫度、復(fù)染的時間等；②將即用型的一抗ER、PR、HER-2、Ki-67、p53直接填充于與主機配套的專門試劑瓶，并編輯掃描試劑瓶上的激光條碼；③將與系統(tǒng)配套的檢測試劑套裝安裝于可拆分的試劑架上，主要包括二抗、DAB顯色液、蘇木素復(fù)染液等；④按說明書要求對與主機配套散裝液體按比例進行配制，主要包括不含有機溶劑的脫蠟液、封蓋清洗緩沖液、氯化鈉檸檬酸鈉清洗緩沖液、CC1細(xì)胞預(yù)處理液、CC2細(xì)胞預(yù)處理液、選擇液等，并安裝在主機相應(yīng)位置的試劑瓶中；⑤編輯打印條碼切片標(biāo)簽（5種抗體為ER、PR、HER-2、Ki-67、p53），將標(biāo)簽貼在切片的相應(yīng)位置上，并將待檢的切片按順序放入染色儀的操作槽中；⑥點擊軟件中的“RUN”鍵，設(shè)定本次檢測的組織片數(shù)，點擊“確認(rèn)”開始運行程序，機器在運行期間不可按“STOP”鍵。此時全部染色工作均由機器完成；⑦自動完成染色后，機器自動報警，取出切片，用洗潔精清洗切片上的油膜和試劑，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

全自動法染色結(jié)果較穩(wěn)定，染色均勻，陽性定位準(zhǔn)確，非特異性著色較少，背景較清晰。手工操作法染色陽性信號相對較弱，邊緣有泛黃現(xiàn)象，但背景較清晰。見表1和圖1～圖5。

3 討論

本實驗采用全自動免疫組化染色儀和手工操作對乳腺癌5種抗體進行染色，現(xiàn)對染色的結(jié)果分析如下。

手工操作法染色：⑴工作流程難以控制和標(biāo)準(zhǔn)化，如手工脫蠟不干凈，石蠟容易留在組織切片上，引起染色不均，陽性信號不強，甚至引起邊緣效應(yīng)。以上結(jié)果使ER、PR、HER-2、Ki-67、p53染色不均及有淺背景，可能與脫蠟過程中手工操作有一定的關(guān)系［5］。⑵在染色過程中，如果滴加抗體時間過長，加上手工操作沒有恒定的濕度環(huán)境，容易造成組織干片出現(xiàn)非特異性背景著色及邊緣效應(yīng)［6］。本實驗手工操作使ER、Ki-67、p53亦出現(xiàn)特異性染色及邊緣效應(yīng)。⑶手工操作過程中人為干擾因素很多，由于實驗技術(shù)人員的手法不同，滴加抗體的量也不同，易與切片上殘留的清洗液混合造成抗體濃度稀釋，使抗體濃度下降，染色的陽性信號強度出現(xiàn)差異，造成實驗的誤差［7］，本實驗中手工所做的ER、PR、HER-2、Ki-67、p53強度稍弱可能與此有關(guān)。⑷實驗研究表明［8］，抗原修復(fù)是影響免疫組化結(jié)果的重要因素，手工操作由于人為原因易造成抗原修復(fù)不足，直接影響免疫組化結(jié)果的信號強度。BenchMark XT全自動免疫組化機可使修復(fù)液沸點高于100℃，同時滿足較高的修復(fù)條件，能使抗原暴露充分。本實驗HER-2、p53由于抗原修復(fù)不足，所以信號變?nèi)?，陽性率偏低?/p>

表1 全自動法與手工操作法對乳腺癌組織染色結(jié)果的比較［n=3］

圖1 乳腺癌ER染色法（4×10）

圖2 乳腺癌PR染色法（4×10）

圖3 乳腺癌HER-2染色法（4X10）

圖4 乳腺癌K i-67染色法（4×10）

圖5 乳腺癌p53染色法（4×10）

全自動法染色：⑴工作流程可全程標(biāo)準(zhǔn)化，從脫蠟、抗原修復(fù)、滴加一抗、二抗直到蘇木素復(fù)染全程自動化［9］。本實驗顯示5種抗體染色均勻，基本上無背景。⑵在整個機器運行過程中，機器內(nèi)部一直保持恒溫、恒濕環(huán)境，不會造成組織干片，背景非特異染色很少，基本上無邊緣效應(yīng)［10］。⑶全程自動化有效避免了手工操作所致的人為誤差，確保檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。本實驗顯示ER、RP、HER-2、Ki-67、p53的強度均比手工操作強。⑷全自動免疫組化染色儀采用先進的加溫技術(shù)，能使抗原修復(fù)更加充分［11］，所以實驗中ER、RP、HER-2、Ki-67、p53的陽性表達普遍比手工操作的染色強。

近年來，病理學(xué)科大力強調(diào)免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制，2000年國際標(biāo)準(zhǔn)化組織已提出了ER和PR的免疫組化染色的質(zhì)量控制體系（QA）［12］，按照國際免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的要求，在病理科成功開展免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)化，全自動免疫組化染色儀則為實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制提供了保證［13］。

每一個商業(yè)化的自動免疫組化平臺都具有戰(zhàn)略設(shè)計的差異，了解這些差異有助于更加客觀地評價自動與手工之間的差異與優(yōu)缺點［14］。本實驗結(jié)果的差異可能與選取的病例數(shù)較少和選取的抗體有關(guān)。有報道國內(nèi)其他實驗室采用手工操作法進行免疫組化片染色效果較佳，有些甚至超過全自動免疫組化儀［15］。因此我們將在以后的工作中總結(jié)更多的病例和選用更多的抗體種類，以更加全面客觀地評價兩者的優(yōu)缺點。

綜上，本實驗結(jié)果表明，與手工操作染色相比，全自動免疫組化儀染色均勻，背景清晰，邊緣效應(yīng)少，染色效果更佳；全自動免疫組化染色平臺具有操作規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)化程度高的特點，可避免人工操作引起的誤差，為病理科免疫組化質(zhì)量控制提供堅實的保障，為臨床診斷提供更加準(zhǔn)確的依據(jù)。

［1］ 唐瑋，劉劍侖，楊華偉，等.南寧市20 472名婦女乳腺癌篩查結(jié)果分析［J］.中國癌癥防治雜志，2014，6（2）：180-182.

［2］ 季永領(lǐng)，杜向慧.乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的綜合治療［J］.中國癌癥防治雜志，2014，6（2）：193-197.

［3］ 顏亞暉，鄭暉.免疫組化化學(xué)切片質(zhì)量的探討［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2003，12（3）：333-334.

［4］ 楊會釵，劉世正.使用新型全自動免疫組化染色儀與手工操作比較的體會［J］.中華實用中西醫(yī)雜志，2005，18（17）：922，292.

［5］ 王小亞，楊清海，黃奇平.免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化（二）［J］.診斷病理學(xué)雜志，2008，15（2）：160-161.

R730.2

A

1674-5671（2015）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.14

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳科研自籌課題（Z2011222）

韋常宏。E-mail：258894453@qq.com