王朝暉 婁曉輝 余一駿 鄭海軍

[摘要] 目的 探討萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護作用。 方法 參照feeney法自由落體致傷法制作創(chuàng)傷性腦損傷模型，大鼠分為對照組、模型組、SFN組及協(xié)同組，每組各15只，對照組不進行撞擊實驗，SFN組術(shù)后每日給予萊菔硫烷腹腔注射，協(xié)同組給予萊菔硫烷與氯化鋰腹腔注射，模型組每日腹腔注射等量生理鹽水，比較術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d各組大鼠神經(jīng)功能缺失程度評分（mNSS）及術(shù)后7 d各組大鼠腦組織含水量、腦組織HE染色結(jié)果以及腦組織中SOD活性、IL-6、TNF-α、MDA水平。 結(jié)果 模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，各時間點mNSS評分均顯著升高（P<0.05）；術(shù)后5 d、術(shù)后7 d，SFN組及協(xié)同組大鼠mNSS評分顯著低于模型組（P<0.05），且協(xié)同組mNSS評分顯著低于SFN組（P<0.05）；術(shù)后7 d，對照組大鼠腦組織含水量為（69.29±2.06）%，模型組為（75.40±1.73）%，SFN組為（73.08±1.06）%，協(xié)同組為（71.27±1.52）%。各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果顯示，SFN組及協(xié)同組其神經(jīng)細胞的損傷較模型組明顯減輕，細胞壞死有所減少，且以協(xié)同組神經(jīng)細胞損傷減輕最為顯著。模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，SOD活性顯著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著上升（P<0.05）；SFN、協(xié)同組與模型組比較，SOD活性顯著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著下降（P<0.05），且協(xié)同組IL-6、TNF-α水平顯著低于SFN組（P<0.05）。 結(jié)論 萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有顯著的神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與減輕大鼠腦水腫、神經(jīng)細胞損傷、抑制氧化應(yīng)激以及炎癥因子的釋放有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 萊菔硫烷；氯化鋰；創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)保護

[中圖分類號] R651.15 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）19-0026-04

創(chuàng)傷性腦損傷（traumtic brain injury，TBI）是一種病情嚴重的機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，同時也是目前導致青壯年死亡以及致殘的一個主要病因[1]。TBI能夠直接破壞大腦神經(jīng)細胞以及腦血管結(jié)構(gòu)，導致患者神經(jīng)功能出現(xiàn)嚴重的損害，TBI激發(fā)的腦水腫、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、血-腦屏障通透性改變以及神經(jīng)細胞凋亡等病理變化可進一步加重對機體腦組織的損害，因此改善TBI患者的預后一直是廣大研究者共同關(guān)注的課題[2]。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一種異硫氰酸鹽，主要存在于十字花科植物當中，其中以西蘭花的含量最多[3]。近年來，關(guān)于SFN抗癌以及細胞保護性能已經(jīng)成為當前研究的熱點；而鋰鹽作為一種抗抑郁-躁狂癥的藥物在臨床中應(yīng)用，近些年來[4，5]，通過體內(nèi)、體外實驗研究均表明鋰鹽能夠有效抑制各種因素所導致的神經(jīng)細胞凋亡。對于萊菔硫烷聯(lián)合鋰鹽對腦損傷作用的研究，目前尚無相關(guān)報道。本研究探討萊菔硫烷協(xié)調(diào)氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級Wistar雄性大鼠60只，實驗動物由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。分籠進行飼養(yǎng)，給予大鼠自由進食與自由飲水，制備腦創(chuàng)傷模型前12 h禁食。

1.2 主要儀器與試劑

低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；Olympus光學顯微鏡（日本Olympus公司，IX-71）；牙科臺式電鉆（寧波醫(yī)療器械公司）；石蠟包埋機（德國Leica公司）；恒冷冰凍切片機（德國Leica公司）。

萊菔硫烷（美國Calbiochem公司）；氯化鋰（廣東西隴化工廠提供，分析純）；SOD檢測試劑盒（南京建成試劑公司）；MDA檢測試劑盒（南京建成試劑公司）；IL-6檢測試劑盒（上海豐翔生物科技有限公司）；TNF-α（上海豐翔生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠TBI模型 參照feeney法[6]自由落體致傷的原理制備中度TBI大鼠模型。使用腹腔注射水合氯醛（10%，300 mg/kg）麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定，頭頂部備皮，使用常規(guī)碘伏消毒，沿大鼠正中線切開頭皮約2.5 cm，將骨膜剝離，暴露出右頂骨。使用牙科臺式電鉆于中線右側(cè)旁2.5 mm、冠狀縫后1.5 mm處鉆一個直徑約為5 mm的骨窗，注意保持硬腦膜的完整，以0.048 N·s（20 g重錘、30 cm高度）的沖擊力撞擊右側(cè)腦部中央前回皮層，然后再使用骨蠟將鉆孔封閉，縫合切口，消毒。打擊有效的標準為撞桿打擊之后，能夠保證硬腦膜的完整性，并且出現(xiàn)局部的腦組織膨隆。術(shù)后給予大鼠4萬單位的硫酸慶大霉素肌肉注射，以預防感染發(fā)生。對照組大鼠接受同樣的手術(shù)操作，但是并不進行沖擊處理。剔除造模不成功或者意外死亡的大鼠，然后用同一批次的大鼠補足。

1.3.2 分組及給藥方法 將60只大鼠分為4組，每組15只，分別為對照組、模型組、SFN組、協(xié)同組。術(shù)后即刻，SFN組給予5 mg/kg SFN腹腔注射，協(xié)同組給予5 mg/kg SFN以及30 mg/kg氯化鋰腹腔注射，對照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射，之后每天注射1次，共注射5 d。

1.4 評價指標

1.4.1 神經(jīng)功能恢復評價 采用改良神經(jīng)功能缺失程度評分（modified neurological severity score，mNSS）標準對各組大鼠神經(jīng)功能進行評分。各組大鼠均在術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d通過感覺、運動、反射活動以及平衡木測試等對大鼠的神經(jīng)功能進行評分，比較各組大鼠不同時間的神經(jīng)功能總分，總分最低為0分，最高為18分，分數(shù)越低則表示大鼠的神經(jīng)功能恢復越好。

1.4.2 腦組織含水量測定 實驗動物術(shù)后第7天，每組大鼠中任取5只，腹腔注射10%水合氯醛2 mL過量麻醉，將其采用斷頭法處死，以打擊灶作為中心，取大鼠損傷側(cè)大約500 mg腦組織，去除凝血后，用冰冷的生理鹽水將腦組織表面的血跡沖洗干凈，然后用濾紙吸取表面殘余的水分，測量其濕重，然后將其置于60℃的烘箱內(nèi)烘烤96 h，取出后稱量其干重，計算各組大鼠腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4.3 腦組織HE染色 各組大鼠分別于術(shù)后7 d隨機抽取5只大鼠，按照上述方法處死，取其腦組織，取出小腦以及低位腦干，以損傷中心為標準，冠狀位切開腦組織，然后立即浸入福爾馬林溶液當中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋。HE染色步驟：石蠟切片（厚度為4 μm）→二甲苯脫蠟→梯度酒精脫水→蒸餾水洗→蘇木素染細胞核→蒸餾水洗→鹽酸酒精分化→氨水細胞核返藍→伊紅染細胞漿→梯度酒精脫水→二甲苯透明→封片→觀察、拍照。

1.4.4 腦組織SOD活性、IL-6、TNF-α以及MDA含量測定 術(shù)后7 d按照上述方法每組處死5只大鼠，取其腦組織，用生理鹽水沖洗后，吸取表面水分，取打擊灶為中心的腦組織約220 g，用電子天平精確測量重量后加入約9倍體積的PBS，制作成損傷大腦皮層的勻漿，并記錄勻漿總體積（mL）。將其離心20 min（4000 r/min），取其上清液，分裝后置于-80℃冰箱內(nèi)備用檢測。各組大鼠腦組織SOD活性、IL-6、TNF-α以及MDA含量測定參照試劑盒使用說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對本研究數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，檢驗水平為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能恢復評分（mNSS）比較

造模后可導致大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失，且術(shù)后1 d以及術(shù)后3 d大鼠神經(jīng)功能的缺失最為嚴重，模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，各時間點mNSS評分均顯著升高（P<0.05）；術(shù)后5 d、術(shù)后7 d，SFN組以及協(xié)同組大鼠mNSS評分顯著低于模型組（P<0.05），且協(xié)同組mNSS評分顯著低于SFN組（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能恢復評分（mNSS）比較（x±s，分）

注：與同期對照組比較，*P<0.05；與同期模型組比較，#P<0.05；與同期SFN組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較

術(shù)后7 d，對照組大鼠腦組織含水量為（69.29±2.06）%，模型組大鼠腦組織含水量為（75.40±1.73）%，SFN組大鼠腦組織含水量為（73.08±1.06）%，協(xié)同組大鼠腦組織含水量為（71.27±1.52）%。見圖1。

2.3 各組大鼠腦組織HE染色

各組大鼠腦組織HE染色見圖2，對照組大鼠腦組織無損傷，顯示其皮層神經(jīng)結(jié)構(gòu)完整，腦組織細胞數(shù)量多，可見明顯的核仁；模型組大鼠損傷區(qū)腦皮層結(jié)構(gòu)不完整，且無明顯核仁，在損傷中心可見細胞溶解、壞死以及軟化灶的形成；SFN組以及協(xié)同組神經(jīng)細胞的損傷較模型組明顯減輕，細胞壞死有所減少，在創(chuàng)傷周邊可以看到新生增殖的組織，且以協(xié)同組神經(jīng)細胞損傷減輕最為顯著。

圖2 各組大鼠腦組織HE染色表現(xiàn)（×400）

（①對照組；②模型組；③SFN組；④協(xié)同組）

2.4 各組大鼠腦組織SOD、IL-6、TNF-α以及MDA水平比較

模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，SOD活性顯著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著上升（P<0.05）；SFN、協(xié)同組與模型組比較，SOD活性顯著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著下降（P<0.05），且協(xié)同組IL-6、TNF-α水平顯著低于SFN組（P<0.05）。見表2。

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是臨床中導致患者死亡和致殘的一個主要疾病，嚴重的TBI患者大多遺留有認知記憶功能的障礙以及感覺、運動功能的缺損。大量的相關(guān)研究顯示[7]，腦損傷后所繼發(fā)的腦水腫、神經(jīng)細胞凋亡、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等均可能再次加重腦組織損傷，甚至導致患者死亡。迄今為止，除常規(guī)的手術(shù)緩解患者腦水腫所引起的顱內(nèi)壓升高外，仍然沒有有效的方法提高患者的神經(jīng)功能恢復。大量研究結(jié)果顯示[8，9]，機體腦損傷后，產(chǎn)生出大量的氧自由基，一方面蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷直接破壞細胞膜以及其他細胞的結(jié)構(gòu)，另一方面則刺激細胞因子以及相關(guān)粘附因子的表達，從而介導炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)，導致腦組織損傷加重；此外，通過抑制線粒體功能等間接途徑，氧自由基能夠激動凋亡信號通路，從而引起細胞凋亡。氧自由基在繼發(fā)性腦損傷病理機制當中起到了非常重要的作用，因此，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及清除氧自由基可能是治療TBI的一個重要思路。

萊菔硫烷（SFN）是一種異硫氰酸鹽，主要存在于十字花科植物當中，研究顯示[10]，SFN具有顯著的抗腫瘤及抗氧化生物學特性。近些年來，隨著對萊菔硫烷研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷對腦出血、腦部嚴重、急性腎功能衰竭、心臟缺血再灌注等均具有良好的保護作用[11，12]。目前體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示，萊菔硫烷能夠有效緩解機體由于氧化應(yīng)激對組織以及細胞的損傷，是一種具有良好前景的抗氧化劑。

近些年來，鋰對于腦缺血的保護作用受到了研究者的關(guān)注，已有研究證實氯化鋰能夠有效減輕由于沙土鼠前腦缺血后導致的海馬區(qū)延遲性神經(jīng)元死亡[13]。Chuang等[14]對大鼠局灶性腦缺血模型研究中發(fā)現(xiàn)，皮下注射（0.5～3.0）mEq/kg氯化鋰能夠有效減少腦缺血后大鼠腦梗死的體積，且呈劑量依賴性。劉安民等研究顯示[15]，氯化鋰對于神經(jīng)細胞的保護作用可能與上調(diào)HSP70蛋白、抑制谷氨酸誘導的MAPL激活有關(guān)。針對萊菔硫烷與氯化鋰不同的神經(jīng)保護作用機制，猜想二者聯(lián)合運用是否具有協(xié)同作用，故本研究探討萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對TBI大鼠的神經(jīng)保護作用。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后SFN組大鼠以及協(xié)同組大鼠其mNSS評分較模型組顯著降低，且協(xié)同組顯著低于SFN組，表明萊菔硫烷能夠?qū)BI大鼠起到顯著的神經(jīng)保護作用，且SFN與氯化鋰聯(lián)合運用，其神經(jīng)保護作用更為顯著，提示二者對TBI大鼠神經(jīng)保護具有協(xié)同作用。從腦組織含水量來看，術(shù)后7 d各TBI大鼠腦組織含水量增加，而SFN組、協(xié)同組腦組織含水量較模型組有所降低，且協(xié)同組低于SFN組；從腦組織HE染色結(jié)果來看，運用SFN治療以及協(xié)同治療后，能夠有效減輕TBI大鼠神經(jīng)細胞的損傷，且協(xié)同組作用更為顯著；從氧化應(yīng)激以及炎癥因子水平來看，模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，SOD活性顯著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著上升（P<0.05）；SFN、協(xié)同組與模型組比較，SOD活性顯著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著下降（P<0.05），且協(xié)同組IL-6、TNF-α水平顯著低于SFN組（P<0.05），表明SFN協(xié)同氯化鋰能夠有效減輕TBI大鼠的腦水腫、減輕大鼠神經(jīng)細胞損傷、清除氧自由基、降低炎癥因子水平。

綜上所述，萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有顯著的神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與減輕大鼠腦水腫、神經(jīng)細胞損傷，抑制氧化應(yīng)激以及炎癥因子的釋放有關(guān)，而具體的作用通路還需要進一步深入研究。

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（2015-01-27）