摘要：將GA4+7產(chǎn)生菌制備菌絲懸液和原生質(zhì)體懸液，用紫外照射疊加氯化鋰誘變的方法進(jìn)行迭代誘變，誘變處理后的菌液涂布平板，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)篩選平板上的單菌落，最后得到一株突變菌GX34-4，相比出發(fā)菌株GA4+7，GX34-4的搖瓶效價(jià)提高約25%，50 L發(fā)酵罐效價(jià)提高約40%。與出發(fā)菌株的外觀和效價(jià)不穩(wěn)定性相比，突變株GX34-4遺傳穩(wěn)定性較好，連續(xù)傳代5次，產(chǎn)量無(wú)明顯降低，在50 L發(fā)酵罐上亦表現(xiàn)穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：原生質(zhì)體；紫外線；氯化鋰；迭代誘變

中圖分類號(hào)：R978 " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on mutagenesis and breeding of GA4+7 producing strain

Xu Xu， Zuo Jianying， and Xiong Renke

（Sichuan Lomon Bio-technolog Co.， Ltd..， Meishan 620000）

Abstract The GA4+7-producing strain was used to prepare mycelium suspension and protoplast suspension， and the iterative mutagenesis was carried out by ultraviolet irradiation and lithium chloride mutagenesis. The mutagenesis-treated bacterial solution was coated on a plate， and the single colonies on the plate were screened by shaking bottle culture. Finally， strain GX34-4 was obtained. Compared to the starting strain GA4+7， the titer of GX34-4 in the shake flask was increased by about 25%， and the titer in the 50 L fermenter was increased by about 40%. The appearance and titer of the starting strain were unstable. The genetic stability of mutant GX34-4 was good， and the yield of mutant GX34-4 was not significantly reduced after five successive generations. which was also stable in a 50 L fermenter.

Key words Protoplast; Ultraviolet irradiation; Lithium chloride; Iterative mutagenesis

赤霉酸（gibberellin acid， GA）是一種廣譜生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，為四萜二環(huán)類化合物，可促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育、種子發(fā)芽、提高果實(shí)結(jié)果率或形成無(wú)籽果實(shí)，其種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)的赤霉菌有100多種，統(tǒng)稱為赤霉素類，活性較高的如：GA1、GA3、GA4、GA7，其中GA3和GA4+7最具有使用和商業(yè)價(jià)值[1]，GA4和GA7因性質(zhì)相似、分離純化困難，常以其混合物即GA4+7存在，GA7主要產(chǎn)生在莖尖及未成熟的種子中，GA4在植物的根、莖、葉及種子中都有發(fā)現(xiàn)。在促進(jìn)植物莖生長(zhǎng)的活性上，赤霉素表現(xiàn)為GA3＞GA7＞GA4[2]，市場(chǎng)上的赤霉酸類調(diào)節(jié)劑多以GA3為主，GA7會(huì)強(qiáng)烈抑制花芽的形成，而GA4對(duì)花芽的形成不僅不會(huì)抑制反而具有促進(jìn)作用，GA4+7混合使用活性適中，可以起到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的作用，同時(shí)，GA4+7可打破休眠且不會(huì)引發(fā)胚軸的生長(zhǎng)，開(kāi)花效果良好，座果率高，能提高水果表皮角質(zhì)層的韌性，預(yù)防褐斑病[3]。

我國(guó)關(guān)于GA4+7方面的研究較少，且其生產(chǎn)成本高，價(jià)格貴，本文主要通過(guò)對(duì)赤霉素GA4+7產(chǎn)生菌GZ19進(jìn)行迭代復(fù)合誘變和選育，獲得產(chǎn)量提高且穩(wěn)定的GA4+7突變型菌株，并在后續(xù)50 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中取得了良好的效果。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

藤倉(cāng)赤霉菌本公司貯存。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）斜面/平板培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

（2）菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：甘氨酸、蔗糖、乙酸銨等[4]。

（3）再生培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基加一定量的NaCl。

（4）高滲緩沖液：蒸餾水配制0.7 mol/L Nacl溶液，滅菌備用[4]。

（5）種子/種子罐培養(yǎng)基；淀粉、大豆餅粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等。

（6）發(fā)酵/發(fā)酵罐培養(yǎng)基：淀粉、大豆餅粉、花生餅粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸銨等。

1.2 幼嫩菌絲懸液的制備和原生質(zhì)體懸液的制備

1.2.1 " "菌絲培養(yǎng)

將斜面菌絲接種菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min

培養(yǎng)約24 h，點(diǎn)種鋪有微孔濾膜的菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，至濾膜上可見(jiàn)薄層菌絲。

1.2.2 " "幼嫩菌絲懸液的制備

參見(jiàn)“1.2.1”進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水洗下濾膜上的菌絲，高速勻漿分散，得到幼嫩菌絲懸液。

1.2.3 " "原生質(zhì)體懸液的制備

參見(jiàn)“1.2.1”進(jìn)行菌絲培養(yǎng)，用過(guò)濾除菌后的復(fù)合酶液（纖維素酶和蝸牛酶用高滲溶液按一定比例組成）洗下，置30 ℃酶解3～4 h，用高滲溶液終止酶解，G2漏斗過(guò)濾除去未酶解的菌絲，得到原生質(zhì)體懸液[5]。

1.3 菌絲和原生質(zhì)體的復(fù)合誘變

1.3.1 紫外誘變

下列操作均在紅光下進(jìn)行，紫外燈預(yù)熱20 min，待光波穩(wěn)定后，將菌絲懸液或原生質(zhì)體懸液放入盛有無(wú)菌轉(zhuǎn)子的平皿中，開(kāi)蓋邊攪拌邊照射一定時(shí)間（20 W，距離20 cm），稀釋涂布PDA培養(yǎng)基或再生培養(yǎng)基，以誘變前的菌落數(shù)做對(duì)照，用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率。

1.3.2 氯化鋰誘變

將菌絲懸液或原生質(zhì)體懸液加入不同濃度的氯化鋰處理一定時(shí)間后，以大量稀釋法終止反應(yīng)，稀釋涂布PDA培養(yǎng)基或再生培養(yǎng)基，以誘變前的菌落數(shù)做對(duì)照，用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率。

1.3.3 紫外+氯化鋰復(fù)合誘變

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，適當(dāng)降低處理濃度和處理時(shí)間，以誘變前的菌落數(shù)做對(duì)照，用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算致死率。致死率=1-誘變前的單菌落數(shù)/誘變后的單菌落數(shù)×100%

1.3.4 迭代誘變

第一次復(fù)合誘變用GZ19的菌絲懸液作為出發(fā)菌，將篩選出的高產(chǎn)菌株作為第二次復(fù)合誘變的出發(fā)菌株，用同樣的方法選擇合適的誘變劑量，處理出發(fā)菌株的原生質(zhì)體，再次篩選更高產(chǎn)的菌株。

1.4 突變株初篩和復(fù)篩

突變株初篩直接將再生平板上生長(zhǎng)出來(lái)的單菌落挖塊接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，33 ℃，200 r/min培養(yǎng)

7 d，放瓶檢測(cè)效價(jià)。

復(fù)篩將單菌落挖塊接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃，

200 r/min培養(yǎng)3 d，再以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，33 ℃，200 r/min培養(yǎng)7 d，放瓶檢測(cè)效價(jià)。

1.5 高產(chǎn)菌株的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將搖瓶篩選出來(lái)的高產(chǎn)菌株在PDA平板上進(jìn)行連續(xù)傳代，從F1代至F5代，每代平板進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)效價(jià)。

1.6 效價(jià)測(cè)定

用HPLC檢測(cè)GA4和GA7含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 原生質(zhì)體懸液條件的選擇

采用含甘氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，可完全消除液體培養(yǎng)基對(duì)后續(xù)酶解的影響，用復(fù)合酶液酶解破壁后，低速1500 r/min離心10 min，再用高滲溶液洗滌，G2漏斗過(guò)濾未酶解的菌絲，即可得到原生質(zhì)體懸液。原生質(zhì)體隨著酶解時(shí)間的增加而增多，見(jiàn)圖1～3，選擇酶解時(shí)間3 h左右。

2.2 誘變劑劑量的選擇

2.2.1 紫外照射時(shí)間的選擇

隨著照射時(shí)間增加，菌絲和原生質(zhì)體的致死率增加，選擇20 W距離20 cm照射時(shí)間選擇40 s為菌絲紫外誘變的最佳條件，30 s為原生質(zhì)體紫外誘變的最佳條件。

2.2.2 氯化鋰濃度的選擇

氯化鋰處理時(shí)間均為3 h，隨著氯化鋰濃度增加，菌絲和原生質(zhì)體的致死率增加，選擇9%～10%濃度的氯化鋰處理3 h為氯化鋰誘變的最佳條件。

2.2.3 復(fù)合誘變條件的選擇

參考單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將紫外照射時(shí)間、氯化鋰濃度適當(dāng)降低進(jìn)行復(fù)合誘變（表1～2）。

選擇復(fù)合誘變的劑量為紫外照射30 s+10%氯化鋰處理菌絲3 h，重復(fù)兩次復(fù)合誘變，致死率73.2%和84.5%（表3）。

選擇復(fù)合誘變的劑量為紫外照射20s+8%氯化鋰處理原生質(zhì)體3 h，重復(fù)兩次復(fù)合誘變，致死率75.5%和70.4%（表4）。

最后確定復(fù)合誘變條件為：紫外照射30 s+10%氯化鋰處理GZ19的幼嫩菌絲懸液3 h，紫外照射

20 s+8%氯化鋰處理GX34原生質(zhì)體3 h。

2.3 搖瓶初篩和復(fù)篩結(jié)果

2.3.1 第一輪復(fù)合誘變

以GZ19作為出發(fā)菌，經(jīng)第一輪復(fù)合誘變，篩選到一株菌GX34，初篩和復(fù)篩數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。

GX34初篩和復(fù)篩效價(jià)比出發(fā)菌株GZ19最高效價(jià)增加10%左右，其中GA7含量占比4%～5%，GA4含量占比95%～96%。

2.3.2 第二輪復(fù)合誘變

以GX34作為出發(fā)菌，經(jīng)第二輪復(fù)合誘變，篩選到一株菌GX34-4，初篩和復(fù)篩數(shù)據(jù)見(jiàn)表6。

GX34-4初篩和復(fù)篩效價(jià)比出發(fā)菌株GZ19最高效價(jià)增加25%左右，其中GA7含量占比3%～5%，GA4含量占比95%～97%。

2.4 遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證

將菌株GX34-4在PDA平板上連續(xù)傳代5代，GA4+7效價(jià)結(jié)果見(jiàn)圖5。

GX34-4連續(xù)傳代5代，效價(jià)和F1代相比沒(méi)有發(fā)生明顯下降，GA4和GA7的占比也沒(méi)有明顯變化，遺傳性狀穩(wěn)定。

2.5 高產(chǎn)突變株GX34-4在50 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵結(jié)果

50 L發(fā)酵罐采用兩級(jí)發(fā)酵，種子罐培養(yǎng)溫度

30 ℃，培養(yǎng)周期40～48 h，尾碳二次降低后轉(zhuǎn)種，接種量10%（V/V），發(fā)酵罐通過(guò)流加50%葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料，溶氧不低于20%，中期用氨水調(diào)控pH，培養(yǎng)溫度33 ℃，發(fā)酵周期8～9 d[6]。

通過(guò)對(duì)初始工藝進(jìn)行優(yōu)化，將淀粉用α-耐高溫淀粉酶解替代50%葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料，可降低成本，效價(jià)與用葡萄糖補(bǔ)料相當(dāng)，工藝穩(wěn)定后再重復(fù)兩次上罐，產(chǎn)量穩(wěn)定（表7）。

2.6 高產(chǎn)突變株GX34-4發(fā)酵液的提取結(jié)果

采用板框固液分離-三級(jí)膜純化-溶劑萃取-減壓濃縮的方法提取GA4+7成品。將50 L發(fā)酵罐的發(fā)酵液用板框分離后，清液經(jīng)0.2 μm微濾膜純化，微濾清液由2000 Da超濾膜除雜，納濾濃縮10～15倍，然后將納濾濃縮液分段酸化，并使用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，萃取液減壓濃縮后，獲得了GA4+7成品。提取收率90%左右，其中GA4含量89%，GA7含量1%。

3 結(jié)論

以外觀和產(chǎn)量不穩(wěn)定的GZ19為出發(fā)菌，采用紫外加氯化鋰復(fù)合誘變和迭代誘變處理，篩選到了一株突變型菌株GA4+7，其搖瓶效價(jià)與出發(fā)菌株相比提高約25%，50 L發(fā)酵罐效價(jià)提高約40%，且遺傳性狀穩(wěn)定，傳代5代效價(jià)沒(méi)有發(fā)生明顯降低。并通過(guò)初步工藝探索，用淀粉酶解液替代葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料，降低了生產(chǎn)成本，最終獲得成品GA4+7，提取收率為90%，GA4含量89%，GA7含量1%。

參 考 文 獻(xiàn)

Macmillan J. Occurrence of gibberellins in vascular plants， fungi， and bacteria[J]. J Plant Growth Regul， 2002， 20： 387-442.

顏方貴， 秦杰， 何增國(guó)， 等. 赤霉素A4、A7的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)， 1994， 21（3）： 163-167.

李佼佼， 楊文革， 胡永紅. 赤霉素A4+7的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 42（5）： 1-4.

譚紅， 龔革， 李志東， 等. 利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)篩選脫落酸高產(chǎn)菌株[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 1998， 4（3）： 281-285.

張文宣， 趙南， 張金兒， 等. 赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體理化誘變－定向篩選模型的建立與應(yīng)用[J]. 化學(xué)與生物工程， "2012， 29（1）： 66-69.

張文宣， 劉義雄， 周金龍， 等. 赤霉素GA4+7在5000L發(fā)酵罐中的中試發(fā)酵工藝[J]. 農(nóng)藥， 2011， 50（11）： 805-807.